牛型布魯氏菌蘋果酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患慢性細(xì)菌性傳染病,該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行并嚴(yán)重危害著人畜健康。布魯氏菌在宿主體內(nèi)生存能力極強(qiáng),在巨噬細(xì)胞內(nèi)具有極強(qiáng)的繁殖能力以及防止殺傷的自我保護(hù)能力,但其不具有經(jīng)典的毒力因子且不能引起強(qiáng)烈的先天性免疫,因而給布魯氏菌的防治帶來了很大的困難。體內(nèi)誘導(dǎo)基因涉及病原菌在體內(nèi)的生存和致病過程,本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室篩選、鑒定的布魯氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原-蘋果酸脫氫酶的

2、酶學(xué)特性及生物學(xué)功能開展研究,探討MDH在布魯氏菌致病過程的機(jī)制。
　　 本研究以牛型布魯氏菌A19株基因組為模板,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出牛型布魯氏菌MDH的編碼基因Malatedehydrogenase(mdh),測(cè)序結(jié)果表明,該基因大小為936bp,與NCBI上公布的布魯氏菌2308(登錄號(hào):NC_007618.1)序列100%同源。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后與表達(dá)載體pET-28a(+)連接,成功構(gòu)建pET-28a-MDH重組質(zhì)粒,

3、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,成功表達(dá)大小約為36KDa的融合蛋白His-MDH。通過優(yōu)化表達(dá)條件,His-MDH主要以可溶性方式表達(dá),利用表達(dá)載體pET-28a(+)上的6His-Tag標(biāo)記,通過Ni+親和層析柱成功對(duì)His-MDH進(jìn)行純化,為進(jìn)一步研究該蛋白的酶學(xué)性質(zhì)及免疫學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。
　　 蘋果酸脫氫酶(MDH)是三梭酸循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵酶,MDH以NAD+為輔因子,催化蘋果酸赫與草酰乙酸鹽

4、的相互轉(zhuǎn)化。本研究對(duì)表達(dá)、純化的布魯氏菌MDH的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究,結(jié)果表明:在體外催化蘋果酸鹽與草酰乙酸鹽的酶促反應(yīng)中,最適pH值為6.0,反應(yīng)最適溫度為42℃,在50℃以下酶的穩(wěn)定性較好,Zn2+、pb2+和Cu2+對(duì)酶有明顯的抑制作用。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)得Km為0.67(mM),Vmax為0.91(umolml-1min-1)。
　　 生物信息學(xué)分析表明,該酶為四聚體,單體存在N-端的NAD結(jié)合區(qū)、催化區(qū)及C-端尾區(qū)三個(gè)結(jié)

5、構(gòu)域,同時(shí)也存在與底物結(jié)合位點(diǎn),疏水結(jié)構(gòu)易形成酶的口袋結(jié)構(gòu),通過對(duì)不同細(xì)菌MDH的酶學(xué)活性位點(diǎn)分析,對(duì)布魯氏菌MDH可能存在的酶活位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。以重組質(zhì)粒pET-28a-MDH為模板,采用重疊引物延伸PCR技術(shù)在布魯氏菌mdh基因中分別引入六個(gè)點(diǎn)突變(R89L、D149V、R152L、H176P、D178V、A231V)后與表達(dá)載體pET-28a(+)連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌B121(DE3)中,通過誘導(dǎo)表達(dá)與純化,成功獲得六個(gè)點(diǎn)突變的重組M

6、DH。通過對(duì)MDH酶學(xué)活性的比較測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)除D178V點(diǎn)突變對(duì)酶活基本無影響外,其它五個(gè)點(diǎn)突變都可以使酶活完全喪失。
　　 WesternBlot檢測(cè)結(jié)果表明,重組His-MDH能與布魯氏菌陽(yáng)性牛血清發(fā)生特異性反應(yīng),表明MDH具有免疫原性。用His-MDH作為包被抗原,對(duì)臨床收集的30份布魯氏菌陽(yáng)性牛血清進(jìn)行ELISA檢測(cè),結(jié)果所有被檢血清均為陽(yáng)性反應(yīng),表明MDH可作為潛在的用于牛型布魯氏菌感染診斷的靶蛋白。生物信息學(xué)對(duì)MD

7、H的氨基酸一級(jí)序列抗原性、親水性、表面可及性以及柔韌性等指標(biāo)的分析,一共預(yù)測(cè)了8條B細(xì)胞線性表位。此外,對(duì)MDH的亞定位結(jié)果表明,MDH為膜相關(guān)蛋白;纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原結(jié)合活性分析以及布魯氏菌感染的Hela細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明:MDH蛋白具有纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原結(jié)合活性,參與布魯氏菌對(duì)宿主細(xì)胞的入侵過程。
　　 本研究通過對(duì)布魯氏菌蘋果酸脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)以及免疫學(xué)特性研究,對(duì)闡述MDH參與布魯氏菌致病過程中的作用提供依據(jù),為進(jìn)一