豬心蘋果酸脫氫酶的制備、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究.pdf

1、蘋果酸脫氫酶(EC1.1.1.37，MDH)是生物體三羧酸循環(huán)(TCA)的關(guān)鍵酶之一，它在檸檬酸循環(huán)中催化蘋果酸形成草酰乙酸，也可以催化草酰乙酸形成蘋果酸。MDH廣泛存在于動(dòng)物組織、細(xì)菌和植物中，在臨床診斷中用于多酶分析及疾病的早期診斷，還可以用于食品中有機(jī)酸含量的測(cè)定，如L-蘋果酸、醋酸、檸檬酸等物質(zhì)的測(cè)定，具有廣泛的應(yīng)用前景。本文以豬心肌MDH為研究對(duì)象，以MDH的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用為目標(biāo)，在MDH的提取純化、酶學(xué)性質(zhì)、酶的穩(wěn)定性以及酶的應(yīng)

2、用等方面進(jìn)行了研究。 以豬心為原料，采用組織破碎、二度硫酸銨鹽析、SephadexG-25凝膠過(guò)濾、DEAESepharoseF.F.離子交換層析、PhenylSepharose6F.F.疏水層析及SephadexG-75Fine凝膠過(guò)濾的提純步驟，分離得到MDH。提取純化的MDH比酶活達(dá)1212.97U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到122.64倍，酶活力回收率為53.64％。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳，獲得單一條帶，達(dá)到電泳純級(jí)別。

3、 以提取的酶為研究對(duì)象，對(duì)MDH的酶學(xué)性質(zhì)和酶的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。來(lái)源于豬心肌MDH的最適作用溫度為50℃，最適作用pH為8.0；在50℃以下，該酶有較好的穩(wěn)定性，但是溫度高于60℃時(shí)，酶活迅速降低；在pH7.0～9.0范圍內(nèi)，酶活相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明該酶有一定的耐堿性；其相對(duì)分子量約為69kDa，含有2個(gè)亞基，每個(gè)亞基的相對(duì)分子量約為34kDa；MDH對(duì)底物草酰乙酸OAA的米氏常數(shù)為84.6μmol/L(pH值8.3)。金屬離子Ag+

4、、Hg2+和Zn2+對(duì)酶活有強(qiáng)烈的抑制作用；而K+對(duì)酶有明顯的激活作用；ca2+和Mg2+對(duì)酶活沒(méi)有明顯影響；一些穩(wěn)定劑對(duì)提高M(jìn)DH的熱穩(wěn)定性有一定的作用，其中甘油的效果最好。 利用MDH開(kāi)發(fā)出一種測(cè)定葡萄酒中L-蘋果酸的新方法。以制備的MDH和谷草轉(zhuǎn)氨酶配成雙酶反應(yīng)體系，對(duì)葡萄酒中L-蘋果酸的含量進(jìn)行了測(cè)定；L-蘋果酸含量的測(cè)定范圍為0.005～0.3g/L，反應(yīng)溫度為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為340nm；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品和葡萄酒樣品精密