HIF-1α小干擾RNA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HIF-1α、SDF-1α和VEGF基因表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分MSCs的培養(yǎng)及HIF-1α siRNA的篩選
　　 目的：貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs，mesenchymal stem cells)，RT-PCR法篩選抑制效果最強(qiáng)的RNA干擾序列。
　　 方法：貼壁法培養(yǎng)MSCs，取第3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)志物CD11b/c、CD34、CD44、CDg0。將MSCs分為五組，單純?nèi)毖踅M(未經(jīng)任何干預(yù))、脂質(zhì)體組(轉(zhuǎn)

2、染空載的脂質(zhì)體)、siRNA609組(轉(zhuǎn)染siRNA609)、siRNA658組(轉(zhuǎn)染siRNA658)、siRNA2070組(轉(zhuǎn)染siRNA2070)。將以上五組細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)24h，RT-PCR檢測(cè)其HIF-1α的基因表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b/c陰性、CD34陰性、CD44陽性、CD90陽性細(xì)胞分別為84.2％±0.2％、97.91％±0.7％、99.8％±0.9％、97.7％±0.4％，CD4

3、4+/CD34一細(xì)胞數(shù)為99.4％±0.4％。2.轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞內(nèi)均能檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)，1ipsome組和空白對(duì)照組未見到綠色熒光信號(hào)。3.RT-PCR結(jié)果顯示，與單純?nèi)毖踅M相比siRNA609、siRNA658、siRNA2070組HIF-1α的基因表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，其中siRNA658組抑制效果最強(qiáng)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1.培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)MSCs相應(yīng)的表面標(biāo)記物。2.MSCs可以轉(zhuǎn)染HIF-1αs

4、iRNA序列。3.siRNA658干擾序列抑制效果最強(qiáng)。
　　 第二部分HIF-1α小干擾RNA對(duì)MSCs的HIF-1α、SDF-1α和VEGF基因表達(dá)的影響
　　 目的：HIF-1α小干擾RNA對(duì)MSCs HIF-1α、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α,stromal derived factor1α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF,Vascular endothelial growth factor)基因表達(dá)的影響

5、。
　　 方法：將MSCs四組，常氧對(duì)照組(無干預(yù)因素)、缺氧組(缺氧24h)、脂質(zhì)體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空載脂質(zhì)體后缺氧24h)、RNA干擾組(轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體介導(dǎo)的RNA干擾序列后缺氧24h)。RT-PCR法檢測(cè)MSCs的HIF-1α、SDF-1α和VEGF mRNA表達(dá)水平， ELISA檢測(cè)MSCs培養(yǎng)上清HIF-1α、SDF-1α和VEGF蛋白表達(dá)水平，CCK8檢測(cè)MSCs培養(yǎng)上清對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：1.

6、RT-PCR顯示，同常氧對(duì)照組相比缺氧組HIF-1α、SDF-1α、VEGF基因表達(dá)增高(P＜0.05)，同脂質(zhì)體對(duì)照組相比RNA干擾組HIF-1α、SDF-1α、VEGF基因表達(dá)降低。2.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同常氧對(duì)照組相比缺氧組條件培養(yǎng)液中的HIF-1α、SDF-1α、VEGF含量增加(P＜0.05)，同脂質(zhì)體對(duì)照組相比RNA干擾組HIF-1α、SDF-1α、 VEGF含量降低(p＜0.05)。3.CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，同常氧對(duì)照組的相

7、比缺氧組條件培養(yǎng)上清可以刺激平滑肌細(xì)胞增殖(P＜0.05)，同脂質(zhì)體對(duì)照組相比RNA干擾組缺氧培養(yǎng)上清促進(jìn)增殖的能力減弱(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1.抑制HIF-1α表達(dá)可以使MSCs的SDF-1α和VEGF基因表達(dá)降低。
　　 2.缺氧可以使HIF-1α,SDF-1α和VEGF基因表達(dá)增高。3.HIF-1α是MSC調(diào)控SDF-1α和VEGF基因表達(dá)的主要因素之一。4.RNA干擾可以降低缺氧培養(yǎng)上清對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞