RNA干擾沉默食管鱗癌細(xì)胞HIF-1α基因?qū)ρ苌蓴M態(tài)相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 　　利用RNA干擾技術(shù)沉默HIF-1α基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)沉默HIF-1α的食管鱗癌Eca-109細(xì)胞株，分別常氧、缺氧條件下研究RNA干擾對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞Eca-109中HIF-1α基因及血管生成擬態(tài)相關(guān)基因的抑制效應(yīng)。 方法： 1、用不同缺氧時(shí)間(0、12、24、36、48、60、72、96h)分別缺氧培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞Eca-109(缺氧培養(yǎng)箱中混合氣體濃度為5％c02、85％N2、10％H2)，以We

2、stern blotting法檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)變化，選擇可以引起HIF-1α蛋白表達(dá)增加的適當(dāng)?shù)娜毖跖囵B(yǎng)時(shí)間。 　　2、選擇四組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)：1組為食管鱗癌細(xì)胞Eca-109，2-4組為RNA干擾HIF-1α基因后篩選出的穩(wěn)定傳代的3株細(xì)胞(分別為H2/20、H3/10、H3/15號(hào)細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室編號(hào)保存)，采用缺氧培養(yǎng)24h，以Western blotting和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)HIF-1

3、α蛋白及mRNA表達(dá)，同時(shí)Western blotting檢測(cè)上皮細(xì)胞激酶(EphA2)、血管上皮鈣粘附素(VE-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、層粘連蛋白5γ2鏈(LN-5γ2)等血管生成擬態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)?！〗Y(jié)果： 　　一、HIF-1α mRNA及蛋白的表達(dá)在常氧扣缺氧不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)Eca109細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HIF-1α mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖一、二)。Eca109細(xì)胞

4、和干擾處理的各組細(xì)胞在常氧和缺氧培養(yǎng)24小時(shí)后檢測(cè)，各組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖三、四)。在Eca-109細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)在缺氧處理時(shí)較常氧培養(yǎng)時(shí)增加，在缺氧后24-48h明顯升高，60h略有降低，72-96h逐漸減少(圖五)。3組RNA干擾的細(xì)胞常氧下HIF-1α蛋白表達(dá)被明顯抑制，且在缺氧處理后亦無(wú)明顯遞增趨勢(shì)(圖六)。 　　二、血管生成擬態(tài)相關(guān)基因的表達(dá)干擾細(xì)胞常氧下EphA2

5、、LN5γ2表達(dá)比未干擾的Eca-109細(xì)胞明顯減少，缺氧處理24h后亦無(wú)明顯增加(圖七)；VE-cadherin、MMP-2表達(dá)較未干擾細(xì)胞略減少，缺氧處理后表達(dá)稍增強(qiáng)(P>0.05)(圖八、九、十)。 結(jié)論： 1、HIF-1α蛋白表達(dá)與缺氧時(shí)間有關(guān)，HIF-1α mRNA表達(dá)沒(méi)有明顯差異，提示缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α調(diào)節(jié)可能發(fā)生在蛋白水平，而非轉(zhuǎn)錄水平。 　　2、所選3株細(xì)胞干擾效率均較高，干擾后HIF-1α蛋

6、白表達(dá)明顯抑制，且缺氧后亦無(wú)明顯增強(qiáng)。說(shuō)明RNA干擾作為一種特異性基因沉默技術(shù)，具有更好的穩(wěn)定性和更優(yōu)越的抑制效果，是基因功能研究的得力工具。 3、VE-cadherin、EphA2、Ln-5γ2及MMP-2等均是與血管生成擬態(tài)關(guān)系密切的基因。本研究中，食管癌細(xì)胞HIF-1α被抑制后EphA2、Ln-5γ2的表達(dá)也明顯下調(diào)，且缺氧處理24h后亦無(wú)明顯增加，VE-cadherin、MMP-2表達(dá)較未干擾細(xì)胞略減少，缺氧處理24h后