HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的療效及機(jī)制的研究.pdf

1、干細(xì)胞移植治療心肌梗死是目前研究的熱點。它在修復(fù)受損心肌，改善心功能方面有巨大潛力。但多項臨床試驗薈萃分析發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植治療改善心功能的效果并不能令人滿意。近年來的研究顯示聯(lián)合干細(xì)胞移植和基因治療能給病人帶來更多的益處。
　　本研究采用缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植治療心肌梗死，探討基因治療聯(lián)合干細(xì)胞移植治療的安全性和有效性。同時探討HIF-1α基因治療聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療發(fā)

2、揮作用的具體機(jī)制。本研究旨在探索使干細(xì)胞移植發(fā)揮最佳療效的措施及機(jī)制。
　　本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因腺病毒載體能有效地轉(zhuǎn)染缺血心肌細(xì)胞，使心肌細(xì)胞高表達(dá)HIF-1α。HIF-1α能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及在缺血心肌的存活，并促進(jìn)缺血心肌毛細(xì)血管新生。術(shù)后4周HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組觀察到MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞。術(shù)后4周HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療組左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)高于其他組

3、。HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合MSCs移植可能是通過增加HIF-1α的表達(dá)，從而促進(jìn)SDF-1α，VEGF等細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)毛細(xì)血管新生，改善缺血心肌微環(huán)境，減少心肌細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)干細(xì)胞歸巢及其在缺血心肌的存活而發(fā)揮其保護(hù)心肌、改善心功能的作用。
　　第一部分 HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠急性心肌梗死模型的實驗研究
　　目的:研究HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠缺血心肌的效果，檢測不同時間點HIF-1αmRNA及蛋白的表達(dá)情況。

4、r>　　方法:27只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組9只:(1) HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組:開胸結(jié)扎SD大鼠左冠狀動脈前降支，制作大鼠心梗模型后經(jīng)心外膜向心梗交界區(qū)心肌內(nèi)注射HIF-1α-GFP腺病毒載體(Ad-HIF-1α-GFP)(6×109PFU);(2)空白對照組:心梗后經(jīng)心外膜向心梗交界區(qū)心肌內(nèi)注射空質(zhì)粒腺病毒載體(Ad-null-GFP)(6×109PFU)。(3)假手術(shù)組:不結(jié)扎左前降支。術(shù)后1周熒光顯微鏡下觀察心肌組織冰凍切片，

5、評價HIF-1α基因轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞情況。術(shù)后1周，2周，4周分批處死大鼠，real-time PCR、Western blot檢測各組大鼠缺血心肌HIF-1αmRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)術(shù)后1周熒光顯微鏡下觀察心肌組織冰凍切片可見HIF-1α-GFP腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染大鼠缺血心肌細(xì)胞。(2) HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組和空白對照組術(shù)后1周，2周，4周HIF-1α mRNA的表達(dá)均呈遞減趨勢。(3)術(shù)后1周HIF-1α基因轉(zhuǎn)染

6、組的HIF-1α mRNA表達(dá)分別是空白對照組和假手術(shù)組的6.77倍和19.5倍;空白對照組HIF-1α的mRNA表達(dá)是假手術(shù)組的2.87倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。(4)術(shù)后2周HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組的HIF-1α mRNA表達(dá)分別是空白對照組和假手術(shù)組的3.12倍和3.35倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)?？瞻讓φ战M和假手術(shù)組HIF-1α mRNA表達(dá)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。(5)術(shù)后4周HIF-1α

7、基因轉(zhuǎn)染組的HIF-1α mRNA表達(dá)分別是空白對照組和假手術(shù)組的4.30倍和4.35倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)?？瞻讓φ战M和假手術(shù)組HIF-1αmRNA表達(dá)之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。(6)假手術(shù)組未檢測到HIF-1α的蛋白表達(dá)。術(shù)后1周，2周，4周HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組和空白對照組的HIF-1α蛋白表達(dá)均呈遞減趨勢。(7)在術(shù)后1周，2周，4周3個時間點HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組HIF-1α的蛋白表達(dá)均明顯高于空白

8、對照組和假手術(shù)組。
　　結(jié)論:(1) HIF-1α-GFP腺病毒載體能成功轉(zhuǎn)染缺血心肌細(xì)胞。(2) HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組和空白對照組術(shù)后1周，2周，4周缺血心肌的HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)均呈遞減趨勢。(3)在術(shù)后1周，2周，4周3個時間點HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于空白對照組和假手術(shù)組。
　　第二部分HIF-1α對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及在缺血心肌中存活影響的研究
　　目的:

9、評價HIF-1α對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及在缺血心肌中存活的影響。
　　方法:分離、純化、培養(yǎng)雄性SD大鼠MSCs，并用Dir熒光染料標(biāo)記用于干細(xì)胞示蹤。雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為2組，每組各10只，兩組大鼠隨機(jī)兩兩配對:(1) HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合MSCs移植治療組:開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作大鼠心梗模型，在心梗交界區(qū)分4點心肌內(nèi)注射雄性大鼠MSCs(1×106個)，同時分4點心肌內(nèi)注射HIF-1α腺病毒載體(Ad-HIF

10、-1α)(6×109PFU);(2)單純MSCs移植治療組:心梗后將雄性大鼠MSCs（1×106個）分4點心肌內(nèi)注射至心梗交界區(qū)，同時分4點心肌內(nèi)注射空質(zhì)粒腺病毒載體(Ad-null)(6×109PFU)。大鼠在術(shù)前，術(shù)后3周行心超檢查。術(shù)后1周，3周分批處死大鼠，用多模式小動物活體成像系統(tǒng)及實時定量PCR(real-time quantitative PCR)檢測大鼠Y染色體雄性鑒別基因sry片段兩種方法評價干細(xì)胞歸巢及存活情況。

11、r>　　結(jié)果:(1)10μ g/ml Dir對MSCs的標(biāo)記率達(dá)97±3％。(2)術(shù)前兩組大鼠LVEF值之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(88.7±7.5％ vs87.4±7.4％，p＞0.05)。術(shù)后3周HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合MSCs移植治療組LVEF值高于單純MSCs移植治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(35.5±8.4％ vs29.8±7.6％，p＜0.05)。(3)心肌組織冰凍切片觀察到移植的MSCs主要分布在注射中心區(qū)，但有向周邊區(qū)域遷移的

12、趨勢，術(shù)后3周在心梗區(qū)能觀察到彌漫散在分布的MSCs。(4) MSCs移植1周后，多模式小動物活體成像系統(tǒng)成像發(fā)現(xiàn):HIF-1α+MSCs組光密度值高于單純MSCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(8.34±0.81×1012 P/s/mm2 vs7.63±0.82×1012P/s/mm2，p＜0.01)。MSCs移植3周后，HIF-1α+MSCs組光密度值高于單純MSCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(10.35±2.34×1012 P/s/mm2 vs8

13、.46±2.98×1012P/s/mm2，p＜0.05)。(5) MSCs移植1周后，real-time quantitative PCR檢測歸巢至心臟并存活的MSCs: HIF-1α+MSCs組干細(xì)胞的存活率為7.4％，MSCs組為6.6％，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。MSCs移植3周后，HIF-1α+MSCs組干細(xì)胞的存活率為1.5％，MSCs組為0.7％，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。
　　結(jié)論:(1) D

14、ir能高效標(biāo)記大鼠MSCs，進(jìn)行干細(xì)胞示蹤。(2)術(shù)后3周HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合MSCs移植治療組LVEF值高于單純MSCs移植治療組。(3)移植的MSCs能向周邊區(qū)域遷移。(4) HIF-1α能提高M(jìn)SCs歸巢及在缺血心肌中的存活率。
　　第三部分 HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的療效及機(jī)制的研究
　　目的:評價HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死的療效及安全性，并探討HIF

15、-1α保護(hù)缺血心肌的具體機(jī)制。
　　方法:SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組11只:(1) HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合MSCs移植治療組:開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作大鼠心梗模型，心梗交界區(qū)分4點心肌內(nèi)注射MSCs（1×106個），同時分4點心肌內(nèi)注射HIF-1α腺病毒載體(6×109PFU);(2)HIF-1α基因轉(zhuǎn)染組:心梗后注射HIF-1α腺病毒載體(6×109PFU)及等量細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM);(3) MSCs移植治療組:心梗后注

16、射MSCs(1×106個)及空質(zhì)粒腺病毒載體(6×109PFU);(4)空白對照組:心梗后注射等量空質(zhì)粒腺病毒載體(6×109PFU)和等量DMEM;(5)假手術(shù)組。大鼠在術(shù)后1周，2周，4周心超檢查后分批處死，CD31抗體檢測新生毛細(xì)血管密度，TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，并檢測HIF-1α，SDF-1α，VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)。大鼠處死后觀察有無新發(fā)腫瘤，心肌組織有無過度炎癥反應(yīng)，評價HIF-1α基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合MS

17、Cs移植治療的安全性。
　　結(jié)果:(1)術(shù)后1周心超檢查顯示HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組大鼠的LVEF值為37.18±10.07％，單純HIF-1α轉(zhuǎn)染組為35.57±6.82％，MSCs移植組為34.97±5.87％，空白對照組為32.16±5.05％。統(tǒng)計分析顯示各組大鼠LVEF之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。術(shù)后2周HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組LVEF值為38.25±5.72％，單純HIF-1α轉(zhuǎn)染組為32.

18、94±7.38％，MSCs移植組為32.23±8.52％，空白對照組為30.72±3.19％。統(tǒng)計分析顯示各組大鼠LVEF之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。術(shù)后4周HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組的LVEF值為40.96±8.91％，單純HIF-1α轉(zhuǎn)染組為30.99±9.00％，MSCs移植組為27.26±6.38％，空白對照組為25.87±5.58％。統(tǒng)計分析顯示HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組LVEF值高于其他組(p＜0.0

19、5)。單純HIF-1α轉(zhuǎn)染組，MSCs移植組和空白對照組LVEF值之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。(2)術(shù)后4周HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組心肌組織冰凍切片觀察到MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞。(3)術(shù)后4周在梗死交界區(qū)，HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組的新生毛細(xì)血管密度為1164±110個/mm2，HIF-1α轉(zhuǎn)染組為1046±120個/mm2，MSCs移植組為725±95個/mm2，空白對照組為592±97個/mm2，假手術(shù)組

20、為166±27個/mm2。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組的新生毛細(xì)血管密度高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（與HIF-1α轉(zhuǎn)染組相比，p＜0.05，與其余組相比，p＜0.01）。在梗死區(qū)，HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組新生毛細(xì)血管密度為978±114個/mm2，HIF-1α轉(zhuǎn)染組為812±91個/mm2，MSCs移植組為573±82個/mm2，空白對照組為469±53個/mm2。HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組的新生毛細(xì)血

21、管密度高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。(4)術(shù)后4周HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組的凋亡指數(shù)為9.1±2.4％，HIF-1α轉(zhuǎn)染組為13.4±1.9％，MSCs移植組為15.6±2.3％，空白對照組為20.5±4.4％，假手術(shù)組為3.6±1.6％。HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組的凋亡率比MSCs移植組和空白對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（與MSCs移植組相比p＜0.05，與空白對照組相比p＜0.01）。HIF-1α+MS

22、Cs聯(lián)合治療組的凋亡率與HIF-1α轉(zhuǎn)染組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。(5)術(shù)后1周，2周，4周HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組和HIF-1α轉(zhuǎn)染組的HIF-1α，SDF-1α，VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)均高于MSCs移植組、空白對照組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。HIF-1α+MSCs聯(lián)合治療組與HIF-1α轉(zhuǎn)染組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。(6)實驗動物未發(fā)現(xiàn)有新發(fā)腫瘤，心肌組織未發(fā)現(xiàn)