攜帶HIF-1α的慢病毒感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞后對其成骨基因表達的影響.pdf

1、目的：提取人低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）的基因片段，構(gòu)建攜帶HIF-1α的慢病毒，感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），通過實時熒光定量PCR檢測BMSCs中成骨因子表達情況。
　　方法：從Hela細胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。設(shè)計引物，以cDNA為模板，PCR擴增HIF-1α基因

2、，PCR產(chǎn)物純化后，經(jīng)雙酶切（BamHI、 PspXI）后克隆至Lv-eGFP慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH-5α，PCR方法篩選出基因重組陽性菌，抽提質(zhì)粒獲得Lv-HIF-1α-eGFP,對HIF-1α基因進行測序鑒定。用構(gòu)建成功的HIF-1α慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293Ta細胞，轉(zhuǎn)染48h后收集富含慢病毒的細胞上清液。將病毒原液梯度稀釋，加入到準備好的293Ta細胞中，培養(yǎng)48h后倒置熒光顯微鏡下觀察帶熒光的細胞數(shù)，計算出病毒滴度。

3、取SD大鼠股骨及脛骨的骨髓，使用直接貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，通過形態(tài)學(xué)觀察及流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD90、CD105對第3代BMSCs進行鑒定。將病毒原液感染生長狀態(tài)良好的BMSCs，72h后倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。細胞實驗分為3組：用攜帶HIF-1α的慢病毒感染BMSCs作為實驗組（簡稱HIF-1α-eGFP-BMSCs組）、用不攜帶HIF-1α的慢病毒感染BMSCs作為空載體組（簡稱eGFP-BMSCs組）、不進

4、行處理的BMSCs作為空白對照組（簡稱BMSCs wildtype組）。各組分別于感染后1d、4d、7d、14d提取細胞總RNA，后反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，設(shè)計引物，使用實時熒光定量PCR法檢測BMSCs中成骨基因BMP-2、OCN、OPN、ALP的表達水平。
　　結(jié)果：HIF-1α基因片段測序及載體質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果表明Lv-HIF-1α-eGFP慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。HIF-1α慢病毒液轉(zhuǎn)染293Ta細胞48h后，用孔稀釋計

5、數(shù)法計算出病毒滴度為5.0×107TU/ml。用流式細胞儀對大鼠BMSCs細胞表面標記物CD90及CD105進行檢測，其陽性率分別為99.8％、97.3%。實時熒光定量PCR法結(jié)果表明實驗組BMSCs中成骨基因BMP-2、OCN、OPN、ALP表達水平較空載體組顯著提高（P＜0.05）：
　?。?）實驗組大鼠BMSCs中BMP-2的表達水平在轉(zhuǎn)染后1d、4d、7d、14d分別為空載體組的2.96倍、6.85倍、6.48倍、6.17

6、倍；
　?。?）實驗組大鼠BMSCs中OCN的表達水平在轉(zhuǎn)染后1d、4d、7d、14d分別為空載體組的2.50倍、5.33倍、7.13倍、7.07倍；
　?。?）實驗組大鼠BMSCs中OPN的表達水平在轉(zhuǎn)染后1d、4d、7d、14d分別為空載體組的2.44倍、4.98倍、6.27倍、7.32倍；
　　（4）實驗組大鼠BMSCs中ALP的表達水平在轉(zhuǎn)染后1d、4d、7d、14d分別為空載體組的2.27倍、4.43倍、5.