HIF-1α基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞治療缺血性心臟病的實驗研究.pdf

1、缺血性心臟病(IHD)是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠狀血流和心肌需求之間不平衡而導致的心肌損害，其發(fā)病率高，死亡率高，嚴重危害著人類的身體健康。 IHD的主要病理改變是不可逆性功能心肌細胞丟失，梗死區(qū)被纖維疤痕替代，以及殘余心肌發(fā)生心室重構(gòu)，進而發(fā)展為充血性心力衰竭。目前的藥物治療、介入治療及冠脈旁路手術(shù)能夠改善心肌缺血，但仍然不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)壞死的心肌，更不能促進心肌細胞的再生。治療性血管發(fā)生根據(jù)血管生成的機制，用人工干預的手段刺激

2、心肌缺血區(qū)小血管生長和側(cè)支循環(huán)形成，從而修復與再生壞死心肌細胞，阻止或延緩心室重構(gòu)和心功能衰竭，是當前治療缺血性心肌病的研究熱點。目前治療性血管發(fā)生可通過三種方法得以實現(xiàn)：生長因子蛋白治療，細胞移植以及基因治療。 缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是細胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，不僅可以結(jié)合多種促血管因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等及其受體基因啟動子上的缺氧反應元件，從而增強相應蛋

3、白的表達，啟動血管新生過程，提高血流灌注，挽救瀕死缺氧的心肌細胞，還可以提高缺血心肌對缺氧環(huán)境的適應性，增強酵解過程，為心肌提供更多的能量代謝，可以設想，HIF-1α用于基因治療具有兩大優(yōu)勢：1.作為上游調(diào)控基因?qū)⒈萔EGF、ANG-2等單純基因治療更具效率；2.HIF-1α在常氧條件下迅速降解，具有可控性，減低了VEGF持續(xù)高表達誘發(fā)血管瘤的危險性。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有分化為心肌細胞、內(nèi)皮細胞的多向分化潛能，且分離方便、增

4、殖容易、遺傳穩(wěn)定、無免疫排斥和倫理障礙等優(yōu)勢，是干細胞治療的理想供體細胞。由此，假設將轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的MSCs移植到心梗區(qū)，以求基因和細胞治療相互協(xié)同、相互促進，能同時、更好地實現(xiàn)心肌再生和血管發(fā)生，是一種極具潛能的替代療法。因此，本研究擬在大鼠的心肌缺血的模型上，通過移植體外轉(zhuǎn)染HIF-1α基因的MSCs，探求這種方法對IHD的治療效果，為進一步的臨床應用提供鋪墊性實驗依據(jù)。本實驗共分為三部分： 第一部分HIF-1α基因

5、克隆及HIF-1α-pcDNA3.1載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建并鑒定HIF-1α真核表達載體HIF-1α-pcDNA3.1。 方法：抽提大鼠心肌細胞mRNA，以mRNA為模版，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR擴增HIF-lα目的基因，連接到pGEM-T載體中，酶切，測序證實，雙酶切將HIF-1α轉(zhuǎn)至pcDNA3.1中。 結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示RT-PCR擴增出的特異片段約2480bp，基因測序結(jié)果與GenBank報道

6、的完全一致，成功構(gòu)建了HIF-1α-pcDNA3.1真核表達載體。 第二部分HIF-1α基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞及其表達 目的：研究HIF-1α真核表達載體HIF-1α-pcDNA3.1體外轉(zhuǎn)染MSCs及HIF-1α基因在MSCs中的表達情況。 方法：采用密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法獲Wistar大鼠MSCs。對其進行表型及生長曲線測定，并進行向成骨細胞及脂肪細胞誘導分化的研究。采用脂質(zhì)體介導技術(shù)將HIF-1α-pc

7、DNA3.1轉(zhuǎn)染至MSCs，在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)和生長情況的變化，通過RT-PCR，Western和ELISA鑒定HIF-1α在細胞中的表達情況。 結(jié)果： 1.采用Pcrcoll密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法易獲取大鼠MSCs，形態(tài)學觀察呈纖維樣細胞外觀；免疫組化檢測結(jié)果為CD44、SH3(CD73)陽性，CD34、CD45陰性，符合MSCs表面標記；流式細胞儀分析，CD44、SH3(CD73)陽性細胞分別占94.

8、7％、97.3％，表明分離培養(yǎng)的MSCs純度較高；經(jīng)誘導后，所培養(yǎng)的MSCs可成功向成骨細胞及脂肪細胞分化。 2.RT-PCR證實采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染的MSCs表達HIF-1α mRNA明顯增加，Westem和。ELISA檢測證實轉(zhuǎn)基因MSCs表達HIF-1α蛋白明顯增加。 第三部分HIF-1α轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠心功能的影響 目的：利用冠脈結(jié)扎法構(gòu)建Wistar大鼠心

9、肌缺血動物模型，探討HIF-1α基因轉(zhuǎn)染MSCs后心肌移植對缺血性心臟病心功能及心室重構(gòu)的影響，并比較聯(lián)合治療與基因治療、細胞治療的療效差別。 方法：80只Wistar近交系大鼠隨機分為5組(各組16只)，首先結(jié)扎前降支，2周后形成慢性心肌缺血動物模型。A組于心梗區(qū)移植轉(zhuǎn)HIF-1α的MSCs(聯(lián)合組)，B組單純移植等量的MSCs(細胞組)，C組單純注射HIF-1α-pcDNA3.1復合物(基因組)，D組注射無血清培養(yǎng)液(對照組

10、)，E組僅用于模型評估(評估組)。另取16只未結(jié)扎冠脈的Wistar近交系大鼠為假手術(shù)組，亦未作任何治療，設為F組。移植4周后以Buxco系統(tǒng)檢測心功能，測量心梗面積，免疫組化檢測Brdu、肌鈣蛋白T雙染確定移植細胞的存活與分化，通過Ⅷ因子染色檢測血管新生，通過RT-PCR檢測HIF-1α基因的體內(nèi)表達。 結(jié)果：冠脈結(jié)扎法制作的大鼠心梗模型，其有效使用率為78.4％(80/102)。移植治療4周后，聯(lián)合組心梗面積小于細胞組與基因

11、組的心梗面積；Buxco檢測心功能顯示LVSP、+dp/dtmax明顯高于其他各組，INEDP、-dp/dtmax明顯低于其他各組；Ⅷ因子染色示聯(lián)合組動物心梗區(qū)毛細血管密度高于細胞組和對照組，較基因組也有一定程度增加；Brdu、肌鈣蛋白T雙染示各治療組心梗區(qū)心肌細胞數(shù)量不同程度多于對照組，部分為雙染陽性細胞；RT-PCR顯示聯(lián)合組HIF-1α的體內(nèi)表達高于其他各組。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了HIF-1α-pcDNA3.1真