聚l-谷氨酸-殼聚糖材料在脂肪組織工程以膽管癌三維培養(yǎng)模型中應用的實驗研究.pdf

1、第一部分聚L-谷氨酸/殼聚糖材料在脂肪組織工程中應用的實驗研究
　　 目的
　　 每年全世界有數(shù)百萬的患者因創(chuàng)傷、腫瘤切除手術(shù)和先天性發(fā)育缺陷等原因會導致的大面積軟組織缺損，大范圍的軟組織缺損是無法自愈的，需要通過手術(shù)進行等方法修復重建。組織修復重建的主要目的不僅僅是恢復正常的組織結(jié)構(gòu)，更重要的是通過對缺損的修復，恢復正常的組織功能，減輕患者焦慮、自卑等不良心理。
　　 傳統(tǒng)的軟組織修復重建方法主要包括游離脂肪移

2、植，復合組織瓣移植或人工合成替代物的植入等方式，它們都存在著各自的缺點，如游離脂肪移植成活率低、容易吸收(體積降低40％-60％);復合組織瓣移植，對供區(qū)組織損傷大，操作復雜，不易塑形;人工合成替代物，如硅膠等可能會引起機體不同程度的排異反應，長期效果可能不理想。
　　 隨著細胞生物學與生物材料科學的發(fā)展，以種子細胞、支架材料構(gòu)建組織為基本特征的組織工程學應運而生，為解決軟組織乃至器官缺損提供了新的思路。脂肪組織工程的基本策略就

3、是利用種子細胞與具有生物相容性和生物降解性的生物材料結(jié)合經(jīng)過生長因子誘導構(gòu)建脂肪組織。成功構(gòu)建組織工程化脂肪的關(guān)鍵在于:①種子細胞的選擇和獲得;②具有良好生物降解性和組織相容性的三維支架材料;③種子細胞增殖和分化的微環(huán)境。
　　 本實驗以人脂肪干細胞(adiposetissue-derivedadultstemcells，ADSC)作為種子細胞，以水溶性聚L-谷氨酸/殼聚糖(poly[L-glutamicacid]/chitos

4、an，PLGA/CS)靜電絡合而成的新型多孔材料作為支架材料，構(gòu)建組織工程化脂肪。探討新型支架材料聚L-谷氨酸/殼聚糖的細胞相容性及與ADSC體外及體內(nèi)成脂的狀況，證實人ADSC能夠在水溶性聚L-谷氨酸/殼聚糖支架材料上構(gòu)建組織工程化脂肪，為脂肪組織工程增添新的內(nèi)容。
　　 方法
　　 一、人脂肪干細胞體外成脂分化潛能的研究
　　 1.應用酶消化法從吸脂手術(shù)的患者中獲取新鮮脂肪組織，提取ADSCs，體外培養(yǎng)擴增，

5、取第3代ADSCs用于實驗研究。
　　 2.流式細胞術(shù)檢測ADSCs分化群表面抗原CD13、CD14、CD34、CD44、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106和CD166的表達。
　　 3.利用不同的生長因子體外誘導，對ADSCs成骨、成脂、成軟骨三向分化性能進行鑒定。
　　 4.體外誘導ADSCs成脂分化21天，觀察細胞形態(tài)學變化，Oil-redO染色及其定量檢測細胞內(nèi)脂滴的形成情況。

6、　　 二、ADSCs于PLGA/CS支架材料體外成脂的研究
　　 1.以聚乳酸PLA微球（直徑在200-300μm）作為致孔劑，利用冷凍干燥技術(shù)和靜電絡合技術(shù)制成球形孔結(jié)構(gòu)的PLGA/CS支架材料。
　　 2.用掃描電鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）和熒光染料DiL標記的方法定性檢測ADSCs在PLGA/CS支架材料上粘附和增殖情況。
　　 3.通過Hoechst33258染色

7、的DNA定量方法，繪制成脂分化誘導組和未誘導組的ADSCs在PLGA/CS支架材料上的增殖曲線。
　　 4.通過定量檢測細胞/材料復合物乳酸脫氫酶的釋放，評價PLGA/CS材料對ADSCs的細胞毒性。
　　 5.用Oil-redO染色法，定量檢測ADSCs接種到PLGA/CS材料經(jīng)成脂誘導后細胞內(nèi)脂滴形成情況，并與未誘導組進行對比。
　　 6.用RT-PCR法檢測誘導組和未誘導組的ADSCs接種PLGA/CS支架

8、材料后的脂特異性基因的表達情況，包括過氧化物酶體增生物激活物受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma2，PPARγ2)、脂肪酸結(jié)合蛋白（fattyacid-bindingprotein，aP2）、脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipase，LPL)、脂連接蛋白(adiponectin)。
　　 三、ADSCs在PLGA/CS支架材料體內(nèi)成脂研究
　　 以ADS

9、C接種在PLGA/CS支架材上后體外成脂誘導2周為實驗組，以空白PLGA/CS支架材料為對照組。12只SCID裸鼠隨機分為兩組，每組6只，將實驗組和對照組材料分別移植于裸鼠皮下。移植6周后取出植入物，測量其體積變化來觀察PLGA/CS支架材料降解情況;OCT包埋進行冰凍切片，Oil-redO染色檢測其脂肪形成情況。
　　 結(jié)果
　　 1.成功的從脂肪抽吸術(shù)獲取的新鮮脂肪組織中，原代培養(yǎng)出ADSCs，細胞活性良好，增殖旺盛

10、。流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示，實驗所用P3ADSCs的CD13、CD34、CD44、CD90、CD105、CD166以及CD49d陽性表達，CD14、CD45與CD31陰性表達;鑒定結(jié)果顯示其具有成骨、成軟骨和成脂的三向分化潛能。成脂誘導過程中，細胞形態(tài)由“長梭形”向圓形脂肪細胞轉(zhuǎn)化，Oil-redO染色及其定量測定顯示隨時間增加，細胞內(nèi)脂滴形成逐漸增多。
　　 2.PLGA/CS材料外觀呈多孔海綿狀，孔徑均一，孔間連通性良好，孔

11、隙率＞90％，對ADSCs顯示出良好的細胞相容性;SEM與DiL染色的共聚焦顯微鏡觀察顯示ADSCs于PLGA/CS支架材料上粘附、增殖良好;PLGA/CS支架材料的細胞毒性對接種的ADSCs影響不大。Oil-redO染色及其定量檢測顯示實驗組脂滴累積明顯高于對照組;RT-PCR結(jié)果顯示，實驗組成脂特異性基因表達均增加，且明顯高于對照組。
　　 3.裸鼠體內(nèi)移植物6周后取出，可見移植物體積完整，有明顯的血管長入;體積測量結(jié)果顯示

12、，實驗組和對照組體積均有不同程度降低，分別為初始體積的90.5％和82.3％，兩組間差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。冰凍切片Oil-redO染色顯示實驗組有新生脂肪形成，而對照組沒有。
　　 結(jié)論
　　 1.ADSCs具有成脂分化潛能，是脂肪組織工程理想的種子細胞。
　　 2.ADSCs在PLGA/CS支架材料上能較好粘附、增殖以及體外和體內(nèi)的成脂分化，說明PLGA/CS支架材料對ADSCs具有良好的生物相容性

13、和促成脂分化的潛能，表明PLGA/CS可能是一種理想的脂肪組織工程細胞支架材料。
　　 3.PLGA/CS支架材料在裸鼠體內(nèi)可以降解，表明其具有生物可降解性，但材料的降解率與體內(nèi)脂肪形成的動力學關(guān)系仍需要進一步研究。
　　 創(chuàng)新性及研究的意義
　　 本研究首次將聚L-谷氨酸/殼聚糖靜電絡合而成的支架材料應用于脂肪組織工程中研究，成功的完成了ADSCs在PLGA/CS支架材料上體外和體內(nèi)脂肪組織的構(gòu)建，為組織工程支

14、架以及整個脂肪組織工程的發(fā)展增加了新的實驗資料。
　　 第二部分聚L-谷氨酸/殼聚糖材料在膽管癌三維培養(yǎng)模型中應用的實驗研究
　　 目的
　　 膽管癌（Cholangiocarcinoma,CC）泛指起源于膽管上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率僅低于肝細胞肝癌，排在肝膽系統(tǒng)腫瘤中的第二位。根據(jù)解剖部位不同，膽管癌可分為肝外膽管癌和肝內(nèi)膽管癌。由于膽管癌發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，發(fā)病時已近中晚期，手術(shù)切除治愈率低，預后不良。<

15、br>　　 流行病學調(diào)查顯示，近年來膽管癌的發(fā)病率明顯有升高趨勢，逐漸成為重要的惡性腫瘤致死的病因，日益受到了國內(nèi)外學者越來越廣泛的關(guān)注。盡管診斷和治療方法不斷的進步，膽管癌的預后依然不容樂觀。建立適宜的研究模型，充分了解膽管癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，對膽管癌的治療和預后改善具有重要意義。
　　 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialtomesenchymaltransition，EMT）是指細胞從上皮形態(tài)到間質(zhì)成纖維形態(tài)的轉(zhuǎn)化過程

16、，主要表現(xiàn)為上皮特點的失去和移動能力的獲得。其重要的改變包括E-鈣粘素（E-cadherin）介導的細胞間粘連、其他上皮標記和細胞極性的喪失，同時伴隨著移動能力的獲得和細胞骨架重組。EMT不僅發(fā)生在胚胎形成早期和器官組織慢性纖維化過程中，也發(fā)生在腫瘤局部侵襲，遠處轉(zhuǎn)移和藥物抵抗的過程中。腫瘤的浸潤過程，腫瘤細胞發(fā)生EMT，彼此分離，移動入基底膜，侵襲到臨近的結(jié)締組織中。目前已證實很多腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移都是通過EMT實現(xiàn)的，如乳腺癌、卵巢癌

17、、肺癌，膽管癌等。EMT的過程受到很多環(huán)境因素和信號通路的調(diào)控。在這些信號通路中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)是EMT發(fā)生及腫瘤和其他病理現(xiàn)象發(fā)展中最重要的誘導因子。
　　 本研究中，我們首先在二維(twodimensional，2D)模型中探討了TGF-β1對肝內(nèi)膽管癌細胞HCCC9810EMT過程的影響，然后利用PLGA/CS體外建立腫瘤細胞三維(threedimens

18、ional,3D)培養(yǎng)模型，觀察了3D模型對HCCC9810細胞生長、增殖及侵襲能力的影響，不僅為膽管癌的基因治療提供了靶點，同時將組織工程理念引領(lǐng)到腫瘤研究中，為腫瘤的生物學特性和治療方法的研究提供了新的思路。
　　 方法
　　 1.以TGF-β110ng/ml濃度體外2D誘導HCCC9810細胞，設為實驗組，正常生長培養(yǎng)液培養(yǎng)的HCCC9810細胞為對照組，采用光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化;用體外劃痕試驗(wound

19、healingassay)檢測細胞移動能力的改變;免疫熒光定性檢測上皮特性指標，包括E-cadherin、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和角蛋白(Pan-cytokeratins，Pan-CK)，以及間質(zhì)特性指標，包括波形蛋白(Vimentin)和纖維粘連蛋白（Fibronectin）的變化以及骨架蛋白F-actin的重組情況;WB和real-timePCR法檢測上皮和間質(zhì)特性指標的蛋白和mRNA水平的表達情況。
　　 2.

20、將HCCC9810細胞接種于PLGA/CS材料上，建立PLGA/CS膽管癌三維培養(yǎng)模型，用SEM和熒光染料DiL標記的方法定性檢測HCCC9810細胞在PLGA/CS材料上粘附和生長情況;用Hoechst33528染色DNA定量檢測HCCC9810細胞在PLGA/CS材料上的增殖情況，并與2D結(jié)果進行對比;用real-timePCR法檢測上皮特性指標（包括E-cadherin和β-catenin）和間質(zhì)特性指標（Fibronectin、

21、Vimentin和N-鈣粘素[N-cadherin]）以及TGF-β1的mRNA表達情況。
　　 結(jié)果
　　 1.體外2D培養(yǎng)下，TGF-β1誘導HCCC9810細胞逐漸失去上皮“鋪路石”形狀，轉(zhuǎn)化成成纖維樣“長梭形”形狀;劃痕試驗顯示實驗組的細胞獲得移動能力;免疫熒光結(jié)果顯示膽管癌細胞不表達E-cadherin，而β-catenin由誘導前細胞膜表達變成誘導后細胞質(zhì)中也有表達，Pan-CK誘導后表達降低;誘導后間質(zhì)細胞

22、標志Vimentin和Fibronectin明顯增強，同時細胞骨架蛋白F-actin發(fā)生重組;WB結(jié)果顯示，上皮細胞特性標志中，E-cadherin無表達，β-catenin和Pan-CK誘導后表達不同程度降低，而間質(zhì)細胞特性標志中，Vimentin和Fibronectin表達明顯增加，N-cadherin表達未有明顯變化;real-timePCR結(jié)果顯示mRNA水平上皮細胞特性標志中，E-cadherin和β-catenin誘導后表達

23、顯著性降低，間質(zhì)細胞特性標志Vimentin，F(xiàn)ibronectin和N-cadherin均不同程度增加，均具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　 2.HCCC9810細胞接種在PLGA/CS材料上表現(xiàn)為粘附、增殖良好;DNA定量檢測結(jié)果顯示細胞于材料上的增殖速率較2D培養(yǎng)速度降低，這更加符合腫瘤體內(nèi)生長的真實情況;real-timePCR結(jié)果顯示，細胞接種材料后，E-cadherin和β-catenin的mRNA表達隨時間逐漸

24、降低，第21天表達顯著降低(p＜0.05)，F(xiàn)ibronectin和vimentin于細胞接種材料后14天和21天mRNA表達明顯增高(p＜0.05);N-cadherin的mRNA表達未見明顯變化;TGF-β1的mRNA水平于細胞接種材料14天和21天后表達明顯增加(p＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.TGF-β1能夠誘導膽管癌發(fā)生EMT，證實TGF-β1及其信號通路在膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有揮重要作用，可作為膽管

25、癌基因治療的靶點。
　　 2.組織工程支架材料PLGA/CS可用于體外3D腫瘤細胞培養(yǎng)模型的建立，較傳統(tǒng)2D培養(yǎng)模式更真實的反應腫瘤體內(nèi)生長情況，且長時間培養(yǎng)，腫瘤細胞自分泌TGF-β1，使細胞移動和侵襲能力增加，符合膽管癌體內(nèi)自分泌或旁分泌TGF-β1實現(xiàn)局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的特點。
　　 創(chuàng)新性及研究意義
　　 1.證實了TGF-β1能夠誘導膽管癌發(fā)生EMT，提出TGF-β1可作為膽管癌基因治療的靶點;