GST-EGFR融合蛋白沖擊樹突狀細胞治療頭頸部鱗狀細胞癌體內外實驗觀察.pdf

1、研究背景： 頭頸部鱗狀細胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)是全球人類第六高發(fā)癌，目前主要治療手段是手術，結合輔助性放療和化療。雖然近三十年來在手術方式及放、化療技術上取得了進步，但這些治療手段的進步在提高HNSCC患者的5年生存率方面的作用卻非常有限。分子靶向性治療是目前腫瘤治療研究的一大熱點。鑒于在許多人類惡性腫瘤中，如HNSCC、非小細胞肺癌、乳腺癌、結腸癌、和胰腺

2、癌等，均有過度表達表皮生長因子受體(Epidermal GrowthFactor Receptor，EGFR)的現(xiàn)象，且其表達水平與患者預后、淋巴結轉移情況均有相關性，因此靶向EGFR的治療被認為是一種很有前景的治療手段。其中EGFR的單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑是研究最為深入的兩種藥物，并已先后用于臨床。但是，臨床試驗表明它們的療效比較有限。 利用腫瘤抗原沖擊致敏樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)激發(fā)免疫系

3、統(tǒng)針對該抗原的特異性免疫應答是目前腫瘤免疫治療研究中的一個熱點。與EGFR的單克隆抗體及小分子酪氨酸激酶抑制劑通過阻斷EGFR的信號傳導通路來抑制腫瘤細胞生長不同，由DC疫苗所激活的細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T-Lymphocyte，CTL)能直接殺傷腫瘤細胞。因此，這種治療方法有著更高的治療效率。將EGFR作為靶點，使用EGFR蛋白沖擊致敏DC激活機體的主動免疫來治療高表達EGFR的HNSCC將可能是一種很有前景的新的治

4、療手段。目前這方面的研究還未見報道。本研究欲利用谷胱甘肽S轉移酶(Glutathione-S-Transfcrase，GST)與EGFR的融合蛋白來沖擊致敏DC，進行治療HNSCC的實驗觀察。通過體外測定CTL殺傷靶細胞的能力及對荷瘤小鼠的腫瘤生長情況的觀察來探討該種治療方法的可行性，以期為頭頸部鱗狀細胞癌的治療找到一種新的治療策略。 研究目的： 重組GST-EGFR融合蛋白；分離培養(yǎng)并致敏DC；通過體外測定CTL殺傷靶

5、細胞的能力及T細胞分泌γ干擾素(Intefferon-γ，IFN-γ)的水平，明確GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC是否能誘導出抗腫瘤的細胞免疫；進一步觀察用重組GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC對HNSCC荷瘤小鼠的治療作用。 研究方法： 1.構建GST-EGFR融合蛋白原核表達載體，并誘導表達及純化。 2.分離培養(yǎng)DC，并用GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏。 3.致敏DC免疫小鼠后，取脾分離T

6、細胞，體外測定CTL活性，及T細胞分泌IFN-γ水平。 4.建立小鼠荷瘤模型，觀察GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC對HNSCC荷瘤小鼠的治療作用。 研究結果： 1.構建GST-EGFR融合蛋白原核表達載體，并誘導表達及純化用RT-PCR擴增高表達EGFR的小鼠HNSCC細胞株SCC Ⅶ的EGFR細胞外段編碼區(qū)cDNA，并測序鑒定，確定為預期片段。用擴增產物成功構建pGEX-4T-2-EGFR原核表達載體，經

7、IPTG誘導表達，并純化后，獲得87kDa大小的GST-EGFR融合蛋白；同時我們對pGEX-4T-2空載體也進行了誘導表達，經純化后獲得26kDa大小的GST蛋白，兩種純化得到的蛋白純度均＞90％。 2.分離培養(yǎng)DC，并用GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏取C3H小鼠的后肢骨骨髓細胞，分離培養(yǎng)DC。培養(yǎng)第五天時流式細胞儀檢測CDllc陽性細胞占59.86％。之后分別用GST-EGFR融合蛋白及GST蛋白沖擊，于第七天流式細胞儀檢

8、測DC，結果CD40、CD80、CD86和MHC II(1-Ak)陽性細胞比例在GST-EGFR融合蛋白沖擊的DC組中分別為58.82％、59.88％、89.42％和90.28％，在GST蛋白沖擊的DC組中分別為54.32％、55.02％、88.36％和89.04％，在未用蛋白沖擊的DC組中分別為17.87％、42.84％、81.07％和80.36％。該結果顯示使用蛋白沖擊DC后，CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ(1-Ak)陽性

9、細胞比例均有提高。 3.致敏DC免疫小鼠，體外測定CTL活性，及T細胞分泌IFN-γ情況 3.1 CTL活性測定 CTL活性檢測結果顯示，在200：1、150：1、100：1和50：1不同的效靶比時，GST-EGFR／DC組靶細胞殺傷率分別為81.71±7.21％、64.05±5.9％、72.21±5.73％和70.51±15.73％，對照DC組的靶細胞殺傷率分別為7.69±2.32％、10.47±2.75％、8

10、.93±0.67％和9.13±1.09％，兩組間差異具有統(tǒng)計學上顯著性意義(P＜0.05)。然而，GST/DC組在不同的效靶比時其靶細胞殺傷率分別為9.47±4.42％、10.22±4.28％、6.76±3.53％和13.55±8.54％，對照DC組靶細胞殺傷率分別為8.99±5.07％、10.74±6.19％、8.24±3.55％和9.93±1.4％，兩組相比沒有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(P＞0.05)。 3.2 測定T細胞IF

11、N-γ的分泌 IFN-γ,的測定結果顯示，GST-EGFR／DC組IFN-γ,濃度為250.36±4.83pg／ml，對照DC組為66.17±18.49pg／ml，兩組間差異具有統(tǒng)計學上顯著性意義(P＜0.05)。而GST／DC組IFN-γ濃度為84.47±12.96pg／ml，對照DC組為102.64±20.36pg／ml，兩組間沒有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(P＞0.05)。 4.GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC抑

12、制SCC Ⅶ實體瘤生長的作用 4.1 GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC對腫瘤的治療作用 各組小鼠均于接受DC免疫之前先接種腫瘤細胞。DC組和GST／DC組小鼠在腫瘤體積上都表現(xiàn)出一種漸進性的快速增長，在腫瘤細胞接種28天后，兩組的腫瘤體積分別為6626.59±1497.07mm3和6126.58±2134.65mm3，兩組間沒有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(P＞0.05)；而GST-EGFR／DC組小鼠的瘤體體積增長速度

13、與DC組和GST／DC組相比要緩慢的多，在腫瘤細胞接種后的第28天，該組的腫瘤體積為3655.43±2238.51mm3，與DC組和GST／DC組的差異均有統(tǒng)計學上顯著性意義(P＜0.05)。此外，GST-EGFR／DC組小鼠的平均生存時間為44±6.38天，也顯著長于DC組的36.43±4.24天和GST／DC組的37.17±3.13天，這種差異具有統(tǒng)計學上顯著性意義(P＜0.05)。 4.2 GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏

14、的DC對腫瘤生長的預防作用 各組小鼠均在接受DC免疫之后再接種腫瘤細胞。DC組和GST／DC組小鼠的腫瘤體積在腫瘤細胞接種26天后分別為9309.32±3493.99mm3和8453.35±2049.26mm3，兩組間沒有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(P＞0.05)；GST-EGFR/DC組小鼠的腫瘤生長較DC組和GST/DC組明顯減緩，在腫瘤細胞接種后的第26天該組的腫瘤體積為3911.5±1656.45mm3，與DC組和GST/D

15、C組相比均有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(P＜0.05)。GST-EGFR/DC組小鼠的平均生存時間為52.75±3.3天，也顯著長于DC組的43.75±5.74天和GST/DC組的41.6±5.37天，這種差異具有統(tǒng)計學意義上的顯著差異(P＜0.05)。 討論： 1.CDllc是小鼠DC的特異性表型，其測定結果能反映DC的純度，我們的結果與文獻中采用同樣方法分離培養(yǎng)DC所得的DC純度一致。CD40、CD80和CD86為共刺激

16、分子，DC成熟時它們的表達會增多，同時MHCⅡ的表達也會增多。實驗結果顯示使用蛋白沖擊DC后，這些分子的表達均增加，提示DC成熟度上升。 2.CTL和IFN-γ的測定結果提示GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC能有效誘導靶向高表達EGFR的HNSCC的CTL，并使T細胞IFN-γ分泌水平上升，而該作用與GST蛋白無關。 3.動物體內實驗觀察結果提示GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC同時具有治療性和預防性抗高表達EG

17、FR的HNSCC實體瘤的作用，能顯著抑制實體瘤的生長，并延長荷瘤小鼠的生存時間。同樣，該作用與GST蛋白無關。 結論： 1.成功獲得高純度GST-EGFR融合蛋白和GST蛋白。 2.分離致敏了DC。 3.GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC能有效誘導靶向高表達EGFR的HNSCC的免疫反應。 4.GST-EGFR融合蛋白沖擊致敏的DC同時具有預防性和治療性抗高表達EGFR的HNSCC實體瘤作用。