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1、Marie Unna遺傳性稀毛癥(MUHH,MIM146550)是一種毛發(fā)周期紊亂導(dǎo)致的遺傳病,呈常染色體顯性遺傳?;颊叱錾竺l(fā)稀少或缺如,兒童期毛發(fā)開(kāi)始生長(zhǎng),質(zhì)硬、卷曲而無(wú)光澤,青春期呈進(jìn)行性毛發(fā)脫落而不再生長(zhǎng)。國(guó)際上將MUHH基因座定位于人染色體8p21區(qū)域,但對(duì)此區(qū)域中與毛發(fā)周期密切相關(guān)的Hairless(HR)基因編碼區(qū)進(jìn)行突變篩查時(shí)都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何致病性突變。本課題組前期研究證實(shí)了MUHH在8p21區(qū)域的定位,并于HR基因5’
2、—UTR區(qū)4個(gè)上游開(kāi)放讀碼框(upstream open reading frame,uORFs)(從5’端至3’端分別命名為U1HR、U2HR、U3HR和U4HR)中的第二個(gè)uORF(U2HR)發(fā)現(xiàn)13種MUHH致病突變。本研究挑選其中7種具有代表性的突變作為研究對(duì)象(包括1種起始密碼子突變、1種終止密碼子突變、1種無(wú)義突變和4種不同的錯(cuò)義突變),旨在探討這7種不同的突變對(duì)HR基因表達(dá)的影響,以及U2HR對(duì)HR基因主要開(kāi)放讀碼框(ma
3、in open reading frame,mORF)表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn),U3HR和U4HR都不影響下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯效率。但本研究發(fā)現(xiàn),U1HR和U2HR在分別破壞起始密碼子后雖然都不改變下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平,但前者使翻譯效率降低了近一倍,而后者使翻譯效率提高近3倍。提示U1HR和U2HR可能分別作為一種激活性和抑制性元件調(diào)控下游HR基因mORF的翻譯。 本研究應(yīng)用螢火蟲(chóng)熒光素酶和EGFP
4、報(bào)告基因系統(tǒng),分析上述7種MUHH致病突變對(duì)下游報(bào)告基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),將這7種突變構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后,EGFP報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平與轉(zhuǎn)染野生型后的水平相當(dāng),但是熒光素酶和EGFP報(bào)告基因的翻譯水平卻獲得2~4倍的升高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,U2HR的突變不是通過(guò)影響HR基因的轉(zhuǎn)錄水平,而是通過(guò)對(duì)HR基因翻譯水平的調(diào)控來(lái)影響HR蛋白在細(xì)胞中的含量;同時(shí)也提示,MUHH發(fā)生的分子機(jī)制是:U2HR發(fā)生失去功能性突變,從而喪失對(duì)下游H
5、R基因mORF翻譯的抑制,引起HR蛋白過(guò)表達(dá)。在U2HR調(diào)控下游HR基因mORF翻譯的分子機(jī)制研究中,本文首先探討了這種調(diào)控作用是否與U2HR所編碼的氨基酸有關(guān)。利用定點(diǎn)誘變方法在U2HR編碼區(qū)C端產(chǎn)生3種同義突變體,與野生型相比,這3種同義突變體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后均未能改變熒光素酶和EGFP報(bào)告基因的翻譯水平,提示U2HR對(duì)下游HR基因mORF翻譯的調(diào)節(jié)不是依賴U2HR的核苷酸序列,而是依賴于U2HR所編碼的氨基酸序列。 本研究通過(guò)
6、消除終止密碼子的方法將U1HR和U2HR分別與EGFP讀碼框融合表達(dá)融合蛋白,Western Blot分析可見(jiàn)印跡條帶分子量大小與預(yù)測(cè)的相當(dāng),這間接提示U1HR和U2HR在生理?xiàng)l件下是可翻譯的。隨后在互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(complementary test)中,過(guò)表達(dá)U2HR多肽并不能挽救U2HR無(wú)義突變體導(dǎo)致的對(duì)下游報(bào)告基因表達(dá)抑制作用的喪失,也不能增強(qiáng)野生型U2HR對(duì)下游報(bào)告基因表達(dá)的抑制作用,提示U2HR不是通過(guò)反式作用,而是通過(guò)順式作用調(diào)
7、控下游HR基因mORF的翻譯。為明確是否U2HR編碼的其他氨基酸也是調(diào)控下游HR基因mORF翻譯所必需,本研究在U2HR編碼區(qū)N端隨機(jī)選擇了兩個(gè)密碼子進(jìn)行錯(cuò)義突變。隨后在報(bào)告基因表達(dá)水平檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),這兩種突變體不影響EGFP報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平,但均使熒光素酶或EGFP的翻譯效率提高了2倍左右,提示U2HR編碼氨基酸的N端區(qū)域?qū)ο掠蜨R基因mORF的翻譯調(diào)控同樣重要。uORF抑制下游mORF翻譯的可能機(jī)制之一是通過(guò)其終止密碼子附近的氨基酸
8、阻滯核糖體向下游滑動(dòng)。為了解U2HR是否可能通過(guò)此機(jī)制抑制下游HR基因mORF的翻譯,本研究采用定點(diǎn)誘變延長(zhǎng)U2HR編碼區(qū)的方法,改變了U2HR終止密碼子附近的氨基酸性質(zhì),隨后將這種突變體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,觀察其對(duì)下游報(bào)告基因表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示報(bào)告基因翻譯水平與轉(zhuǎn)染野生型的相比基本沒(méi)有差異,這提示U2HR終止密碼子附近的氨基酸可能不影響核糖體在mRNA上的滑動(dòng)。本研究還在U2HR起始密碼子AUG下游(+4位)插入單堿基G,形成
9、移碼突變,改變野生型U2HR編碼的包括終止密碼子附近氨基酸在內(nèi)的幾乎所有氨基酸。將該突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染野生型的相比,下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄水平基本不變,但翻譯效率卻升高了近2倍。該結(jié)果提示U2HR可能通過(guò)其編碼的非終止密碼子附近的氨基酸序列影響核糖體在mRNA上的滑動(dòng),下調(diào)HR基因mORF翻譯。如果U2HR在生理?xiàng)l件下翻譯為多肽,其可能通過(guò)與翻譯裝置中某些組分發(fā)生作用而影響核糖體在mRNA上的滑動(dòng)。本研究采用酵母雙雜交系統(tǒng)和哺乳動(dòng)
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