遺傳性心律失常的分子機(jī)制研究.pdf

1、早期復(fù)極是一種常見(jiàn)的心電圖現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為J點(diǎn)抬高或J波增大,QRS-ST間切跡、頓挫,常伴ST段抬高和T波直立。在年輕男性、運(yùn)動(dòng)員以及黑人中多見(jiàn)。半世紀(jì)以來(lái),人們一直將其視為一種良性的生理性變異。然而,近期研究表明,早期復(fù)極可能與惡性心律失常以及猝死相關(guān),且存在早期復(fù)極者發(fā)生猝死的危險(xiǎn)與J波與ST段抬高出現(xiàn)的導(dǎo)聯(lián)及其抬高的幅度有關(guān)。在此基礎(chǔ)上,Antzelevitch和Yan提出了一個(gè)新的概念用來(lái)描述這一心電現(xiàn)象,即遺傳性J波綜合征。

2、根據(jù)心電圖上J波出現(xiàn)的導(dǎo)聯(lián)和患者的臨床預(yù)后,進(jìn)一步將遺傳性J波綜合征分為四個(gè)亞型:(1)Ⅰ型早期復(fù)極綜合征(early repolarization syndrome,ERS):早期復(fù)極J波定位于前側(cè)壁V4～V6導(dǎo)聯(lián),一般為良性變異；(2)Ⅱ型ERS:早期復(fù)極J波定位于下壁Ⅱ、Ⅲ、aVF導(dǎo)聯(lián),易發(fā)生室速或室顫；(3)Ⅲ型ERS:早期復(fù)極J波定位于全心室,包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVF以及V1～V6導(dǎo)聯(lián),極易發(fā)生室速或室顫；(4)Brug

3、ada綜合征:右側(cè)胸前區(qū)V1～V3導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)典型的Brugada波,易發(fā)生室速或室顫。研究表明,CACNA1C、CACNB2和CACNA2D1基因突變或KCNJ8基因突變導(dǎo)致的“功能增強(qiáng)”(gain-of-function)可能與ERS的發(fā)病相關(guān)。
　　 目的:
　　 定位一個(gè)ERS家系的致病基因；識(shí)別基因突變位點(diǎn)；在細(xì)胞和分子水平上研究該突變對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)的功能的影響并探討基因突變致ERS的發(fā)病機(jī)制。
　　 方

4、法:
　　 收集ERS家系及500例無(wú)血源關(guān)系的健康對(duì)照者的外周靜脈血。采用候選基因策略對(duì)先證者SCN5A、KCND3、CACNA1C、CACNB2、KCNE3、SCN1B和KCNJ8基因的全部外顯子和外顯子-內(nèi)含子結(jié)合部位進(jìn)行篩查,以期發(fā)現(xiàn)致病基因。然后,分別在ERS家系和健康對(duì)照者中篩查所發(fā)現(xiàn)的基因突變,評(píng)估該突變?cè)谌巳褐谐霈F(xiàn)的頻率。在野生型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變體質(zhì)粒。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在轉(zhuǎn)染野生型或突變

5、體質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞上記錄通道電流,研究相應(yīng)通道的電生理功能。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法研究野生型或突變體通道蛋白mRNA的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫熒光共聚焦顯微鏡定性檢測(cè)野生型或突變體通道蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)的分布情況。
　　 結(jié)果:
　　 先證者,女,19歲。反復(fù)性暈厥4年。暈厥前心電圖檢查顯示在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVF和V2～V6導(dǎo)聯(lián)上出現(xiàn)廣泛的大J波以及ST段弓背向下型抬高,隨即室顫發(fā)作。基線心電圖檢查顯示在下壁Ⅱ、Ⅲ、a

6、VF導(dǎo)聯(lián)上可見(jiàn)到駝峰樣的小J波?；蛐头治霭l(fā)現(xiàn),先證者SCN5A基因上存在兩個(gè)新的基因變異,即G4297C和T5457C。前者為錯(cuò)義突變,該突變導(dǎo)致位于鈉通道α亞基第三結(jié)構(gòu)域的孔形成區(qū)和S6跨膜區(qū)之間細(xì)胞外環(huán)處的第1433位氨基酸殘基由甘氨酸變?yōu)榫彼?。而后者為一同義多態(tài)性,該多態(tài)性并未引起氨基酸序列的改變。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型和突變體鈉通道的HEK293細(xì)胞上記錄鈉電流(sodium current,INa),發(fā)現(xiàn)與野

7、生型通道相比,G4297C突變不僅導(dǎo)致鈉通道的電流密度明顯下降,而且改變了鈉通道的動(dòng)力學(xué)特性,使其穩(wěn)態(tài)激活曲線右移、半激活電壓變大、激活速度變慢以及穩(wěn)態(tài)失活后恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,野生型和G4297C突變體鈉通道的mRNA的表達(dá)水平相當(dāng)。然而,免疫熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與野生型鈉通道不同,G4297C突變體通道在細(xì)胞膜上的熒光表達(dá)量顯著降低。進(jìn)一步,在細(xì)胞漿中也未測(cè)到可見(jiàn)熒光,說(shuō)明G4297C突變并未引起鈉通道轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷,而

8、是可能通過(guò)影響鈉通道轉(zhuǎn)錄后的翻譯過(guò)程或者加速鈉通道蛋白的降解,從而引起細(xì)胞膜上的鈉通道蛋白數(shù)量減少。此外,研究表明,當(dāng)G4297C突變和T5457C多態(tài)性位于同一條鏈上時(shí),T5457C多態(tài)性對(duì)G4297C突變具有部分拯救作用,可使突變體鈉通道的電流密度部分得到恢復(fù),但對(duì)其通道動(dòng)力學(xué)特性無(wú)影響。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,G4297C-T5457C-SCN5A突變體通道m(xù)RNA的表達(dá)水平約為G4297C突變體通道的6倍。此外,免疫熒光共聚焦實(shí)

9、驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)轉(zhuǎn)染G4297C突變體質(zhì)粒相比,在轉(zhuǎn)染了G4297C-T5457C突變體質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞上,綠色熒光的表達(dá)量顯著增高,并且主要分布在細(xì)胞膜上。結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果,我們推測(cè)T5457c多態(tài)性對(duì)G4297C突變體鈉通道的拯救作用可能是通過(guò)增加突變體通道的mRNA水平,進(jìn)而增加其在細(xì)胞膜上的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)的。
　　 結(jié)論:
　　 1、SCN5A基因的G4297C突變通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致鈉通道出現(xiàn)“功能減弱