遺傳性抗活化蛋白C癥家系的臨床和分子發(fā)病機制研究.pdf

1、背景1993年Dahlback等首次報道了抗活化蛋白C癥（Resistance to activatedprotein C，APC-R）。目前的研究證實，APC-R的主要分子學(xué)機制是凝血因子V（FV）基因突變導(dǎo)致氨基酸變異（FV Arg506Gln，F(xiàn)V Leiden），它是高加索人群中發(fā)生率最高的血栓危險因素（遺傳性易栓癥）之一。但FV Leiden突變分布具有明顯的地域性差異，在我國、韓國和日本等亞洲國家，無論健康人或血栓患者，雖可

2、發(fā)現(xiàn)APC-R陽性，但FV Leiden的檢出率幾乎為零，提示亞洲人群中可能存在除FVLeiden以外的其他與APC-R相關(guān)且伴高血栓傾向的基因缺陷。
　　 目的研究-遺傳性APC-R且伴靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）史的家系的臨床和分子發(fā)病機制，以期發(fā)現(xiàn)新的與APC-R相關(guān)的遺傳缺陷，并初步探討與新遺傳缺陷相關(guān)的凝血因子功能異常。
　　 方法：
　　 1.采集1例APC-R

3、陽性的VTE患者（先證者）及家系成員（4例）的臨床資料和血液樣本，進行系統(tǒng)的家系調(diào)查。
　　 2.采用凝固法檢測.APC-R、蛋白S，采用發(fā)色底物法檢測蛋白C、抗凝血酶，采用一期法測定凝血因子Ⅴ、Ⅷ活性（FV：C、FⅧ：C）。
　　 3.采用：PCR-RELP和直接測序方法除外FV Leiden突變、FV Cambridge/HongKong突變。
　　 4.擴增FV基因的25個外顯子，對其PCR產(chǎn)物直接測序，將

4、測序結(jié)果與Genebank已知的DNA序列進行比較。
　　 5.在健康體檢者和血栓性疾病患者中篩查新發(fā)現(xiàn)的FV基因突變，比較兩者的等位基因頻率。
　　 6.將先證者血漿/標(biāo)準(zhǔn)血漿以不同比例與乏FV血漿混合后利用凝血法（COATEST（）APCTM Resistance：Kit）測定APC-sr值，初步探討異常FV導(dǎo)致APC-R的機制。
　　 結(jié)果：
　　 1.先證者為53歲女性，因左下肢腫痛、進行性呼吸困

5、難，經(jīng)下肢血管彩超、CT肺血管造影等檢查，確診下肢深靜脈血栓和肺栓塞。經(jīng)查，患者除APC-R陽性外，無其他常見的獲得性或遺傳性易栓因素。經(jīng)低分子肝素繼之口服華法林抗凝治療癥狀緩解，至今已隨訪16個月，VTE未復(fù)發(fā)。
　　 2.先證者的雙親非近親結(jié)婚，家族中曾有一姐2年死于“VTE”，其余成員均無血栓事件。5名家系成員中有4人（包括先證者）檢出APC-R陽性，另1人為APC-R陰性；其余易栓指標(biāo)（包括抗磷脂抗體、PS、PC、AT-

6、Ⅲ、FVⅢ：C等）均陰性。確定為遺傳性APC-R家系，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。
　　 3.全部家系成員均未檢出FV Leiden和FV Cambridge/Hong Kong突變等常見引起APC-R的FV基因缺陷。
　　 4.測序結(jié)果經(jīng)比較，鑒定到2個突變位點，分別是：①第10外顯子中的第1628個核苷酸突變（G1628→A），導(dǎo)致第485個氨基酸置換（R485K）。FV R485K為一種已報道可能與APC-R相關(guān)的F

7、V基因突變，但該突變以純合狀態(tài)同時存在于該家系中所有成員，且其在健康體檢者和APC-R陰性的血栓性疾病患者中等位基因頻率（A）分別為64％、60％，兩者無顯著差異；②第13外顯子中的第2172個核苷酸突變（G2172→C），導(dǎo)致第666個氨基酸置換（E666D）。FV E666D為一新發(fā)現(xiàn)的FV基因突變，以雜合狀態(tài)存在于該家系中所有APC-R陽性成員，而在陰性成員中則缺乏，在健康體檢者和APC-R陰性的血栓性疾病患者中也均未被檢出。FV

8、E666D位于APC水解FVa的第3個位點-Arg679附近，有可能通過干擾APC對FVa的水解引起APC-R。
　　 5.由于FVa對APC的敏感性與FV濃度無關(guān)，而APC輔因子活性可隨FV濃度增加而增加。利用含F(xiàn)V E666D突變蛋白的先證者血漿進行的初步功能研究顯示，在FV比例很低的情況下（即FV為2.5％），先證者血漿與標(biāo)準(zhǔn)血漿的APC-sr值的差異不大，提示異常FV被APC滅活的敏感性與正常FV相當(dāng)；隨FV比例的增加，

9、先證者血漿的APC-sr值的增加幅度（即斜率）小于正常血漿，提示異常FV作為APC裂解FVⅢa的輔因子活性低于正常FV。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)并證實了我國首個伴有VTE家族史的遺傳性APC-R家系。
　　 2.在國際上首次發(fā)現(xiàn)FV基因第13外顯子E666D突變（FV E666D），此突變在該家系所有APC-R陽性成員中以雜合狀態(tài)存在，在APC-R陰性家系成員、健康體檢者和APC-R陰性血栓患者中均未