部分遺傳性血友病A的分子發(fā)病機制研究.pdf

1、血友病A是一種臨床最為常見的遺傳性出血性疾病，由 F8基因突變而導致凝血因子VIII蛋白量的異?；蚬δ墚惓＃瑸閄連鎖隱性遺傳。F8基因突變譜廣泛，導致重型血友病A的基因缺陷主要有：內(nèi)含子22倒位（約占45％）、內(nèi)含子1倒位（約占2-5%）、錯義突變（15%）、無義突變（10%）、小片段缺失及插入（16%）、大片段缺失（3-5%）、剪切位點突變（3%）及未知突變（5%）等。本研究對10例疑似 F8基因大片段缺失及13例未知基因突變，1例異

2、常內(nèi)含子1倒位，1例His99Arg點突變的血友病A家系進行表型診斷、家系調查、基因分析等，探討其分子發(fā)病機制。
　　首先，本研究對23個血友病A家系中23例先證者（10例疑似F8基因大片段缺失及13例未知基因突變）及16例女性進行拷貝數(shù)變異檢測。23例血友病A患者中10例疑似F8基因大片段缺失及9例未知基因突變的患者診斷為重型血友病A，其余4例未知基因突變患者中1例為中型及3例為輕型血友病A。運用AccuCopy多重熒光競爭PC

3、R法證實10例患者存在F8基因大片段的缺失，并在13例未知基因突變中發(fā)現(xiàn)5例F8基因大片段重復的病人，其余8例病人F8基因拷貝數(shù)正常。運用AccuCopy多重熒光競爭PCR法對16例女性進行攜帶者檢測，發(fā)現(xiàn)4例F8基因大片段缺失及5例大片段重復的女性攜帶者。通過運用長鏈PCR，引物步移策略，基因組步移技術精確定位10例F8基因大片段缺失病人斷裂點的位置，發(fā)現(xiàn)在8例缺失斷裂點融合處存在微小同源序列，5例缺失在斷裂點融合處插入了部分堿基，推

4、測非同源末端連接及微小同源介導的復制依賴的重組機制為本研究中F8基因大片段缺失的主要機制。運用RepeatMasker，RepeatAround，QGRS MAPPER，Z-HUNT Online，F(xiàn)uzznuc等軟件對斷裂點區(qū)域進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)一些重組相關的元件（重復元件，非-B DNA構象形成元件，重組相關基序等）可能對缺失的發(fā)生發(fā)揮了一定的作用。
　　在導致重型血友病A的F8基因突變中，內(nèi)含子1倒位約占2%-5%。內(nèi)含

5、子1倒位主要是由F8基因內(nèi)含子1中一段1040 bp的序列（Int1h-1）與F8基因上游約125 kb的一段同源序列（Int1h-2）發(fā)生染色體內(nèi)的同源重組而導致的。本研究運用序列特異PCR對內(nèi)含子1倒位檢測，發(fā)現(xiàn)一種新的異常內(nèi)含子1倒位形式：正常形式的Int1h-2（1191 bp）和倒位形式的Int1h-1/2（1776 bp）同時存在，而缺少正常形式的Int1h-1（1908 bp）和倒位形式的Int1h-2/1（1323 bp

6、）。AccuCopy多重熒光競爭PCR顯示先證者F8基因26個外顯子拷貝數(shù)均正常。運用長鏈PCR、引物步移策略、基因組步移技術、Affymetrix CytoScan CNV芯片技術及DNA實時熒光定量 PCR技術來檢測并分析此異常1號內(nèi)含子倒位的重組機制。此復雜重組包含一段2556 bp序列的缺失，188.9 kb二倍體重復和38.4 kb的三倍體重復，并伴有Int1h-1/2倒位的發(fā)生，推測微小同源介導的復制依賴的重組（FoSTeS

7、/MMBIR）和非等位基因同源重組機制共同介導了此次異常重組機制的發(fā)生。基因組步移技術發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1的斷裂點位于154231824（hg19），并與F8基因上游260kb左右的154604422（hg19）相連，F(xiàn)8基因1號內(nèi)含子缺失2556 bp序列。運用Affymetrix CytoScan CNV芯片技術顯示F8基因上游260 kb存在一段188.9 kb拷貝數(shù)增為2的區(qū)域中共有3個基因，分別為VBP1，RAB39B和CLIC2，并

8、沒有導致病人血友病A以外的其他表型。
　　統(tǒng)計分析約有5%-10%的HA患者FVIII活性檢測結果與臨床出血程度不符，本研究對1例His99Arg突變患者FVIII:C檢測結果差異大及一期法和二期法 FVIII活性檢測結果不相符的病人進行了分子發(fā)病機制的研究?；?APTT途徑的一期法和基于發(fā)色底物法途徑的二期法檢測FVIII活性，發(fā)現(xiàn)先證者一期法（14.7%）與二期法（1.2%）FVIII活性檢測結果相差十倍以上。在不同溫度條件

9、（37℃，25℃，4℃，-20℃，-80℃）下，患者血漿 FVIII在較短的時間內(nèi)活性會迅速喪失；56℃熱變性分析顯示突變蛋白重鏈和輕鏈解離速度比正常人快3倍左右。F8基因分析發(fā)現(xiàn)患者存在g.30716 A>G突變而導致His99Arg氨基酸改變。三維結構模型對FVIII蛋白A1和A3亞基結合面上疏水作用的分析顯示，His99被A1亞基4個氨基酸殘基（Ala100，Val101，Tyr105及 His161）側鏈形成的疏水作用構架所包繞