部分遺傳性血友病A的分子發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、血友病A是一種臨床最為常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病，由 F8基因突變而導(dǎo)致凝血因子VIII蛋白量的異常或功能異常，為X連鎖隱性遺傳。F8基因突變譜廣泛，導(dǎo)致重型血友病A的基因缺陷主要有：內(nèi)含子22倒位（約占45％）、內(nèi)含子1倒位（約占2-5%）、錯(cuò)義突變（15%）、無(wú)義突變（10%）、小片段缺失及插入（16%）、大片段缺失（3-5%）、剪切位點(diǎn)突變（3%）及未知突變（5%）等。本研究對(duì)10例疑似 F8基因大片段缺失及13例未知基因突變，1例異

2、常內(nèi)含子1倒位，1例His99Arg點(diǎn)突變的血友病A家系進(jìn)行表型診斷、家系調(diào)查、基因分析等，探討其分子發(fā)病機(jī)制。
　　首先，本研究對(duì)23個(gè)血友病A家系中23例先證者（10例疑似F8基因大片段缺失及13例未知基因突變）及16例女性進(jìn)行拷貝數(shù)變異檢測(cè)。23例血友病A患者中10例疑似F8基因大片段缺失及9例未知基因突變的患者診斷為重型血友病A，其余4例未知基因突變患者中1例為中型及3例為輕型血友病A。運(yùn)用AccuCopy多重?zé)晒飧?jìng)爭(zhēng)PC

3、R法證實(shí)10例患者存在F8基因大片段的缺失，并在13例未知基因突變中發(fā)現(xiàn)5例F8基因大片段重復(fù)的病人，其余8例病人F8基因拷貝數(shù)正常。運(yùn)用AccuCopy多重?zé)晒飧?jìng)爭(zhēng)PCR法對(duì)16例女性進(jìn)行攜帶者檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4例F8基因大片段缺失及5例大片段重復(fù)的女性攜帶者。通過(guò)運(yùn)用長(zhǎng)鏈PCR，引物步移策略，基因組步移技術(shù)精確定位10例F8基因大片段缺失病人斷裂點(diǎn)的位置，發(fā)現(xiàn)在8例缺失斷裂點(diǎn)融合處存在微小同源序列，5例缺失在斷裂點(diǎn)融合處插入了部分堿基，推

4、測(cè)非同源末端連接及微小同源介導(dǎo)的復(fù)制依賴的重組機(jī)制為本研究中F8基因大片段缺失的主要機(jī)制。運(yùn)用RepeatMasker，RepeatAround，QGRS MAPPER，Z-HUNT Online，F(xiàn)uzznuc等軟件對(duì)斷裂點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)一些重組相關(guān)的元件（重復(fù)元件，非-B DNA構(gòu)象形成元件，重組相關(guān)基序等）可能對(duì)缺失的發(fā)生發(fā)揮了一定的作用。
　　在導(dǎo)致重型血友病A的F8基因突變中，內(nèi)含子1倒位約占2%-5%。內(nèi)含

5、子1倒位主要是由F8基因內(nèi)含子1中一段1040 bp的序列（Int1h-1）與F8基因上游約125 kb的一段同源序列（Int1h-2）發(fā)生染色體內(nèi)的同源重組而導(dǎo)致的。本研究運(yùn)用序列特異PCR對(duì)內(nèi)含子1倒位檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一種新的異常內(nèi)含子1倒位形式：正常形式的Int1h-2（1191 bp）和倒位形式的Int1h-1/2（1776 bp）同時(shí)存在，而缺少正常形式的Int1h-1（1908 bp）和倒位形式的Int1h-2/1（1323 bp

6、）。AccuCopy多重?zé)晒飧?jìng)爭(zhēng)PCR顯示先證者F8基因26個(gè)外顯子拷貝數(shù)均正常。運(yùn)用長(zhǎng)鏈PCR、引物步移策略、基因組步移技術(shù)、Affymetrix CytoScan CNV芯片技術(shù)及DNA實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)并分析此異常1號(hào)內(nèi)含子倒位的重組機(jī)制。此復(fù)雜重組包含一段2556 bp序列的缺失，188.9 kb二倍體重復(fù)和38.4 kb的三倍體重復(fù)，并伴有Int1h-1/2倒位的發(fā)生，推測(cè)微小同源介導(dǎo)的復(fù)制依賴的重組（FoSTeS

7、/MMBIR）和非等位基因同源重組機(jī)制共同介導(dǎo)了此次異常重組機(jī)制的發(fā)生?；蚪M步移技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1的斷裂點(diǎn)位于154231824（hg19），并與F8基因上游260kb左右的154604422（hg19）相連，F(xiàn)8基因1號(hào)內(nèi)含子缺失2556 bp序列。運(yùn)用Affymetrix CytoScan CNV芯片技術(shù)顯示F8基因上游260 kb存在一段188.9 kb拷貝數(shù)增為2的區(qū)域中共有3個(gè)基因，分別為VBP1，RAB39B和CLIC2，并

8、沒(méi)有導(dǎo)致病人血友病A以外的其他表型。
　　統(tǒng)計(jì)分析約有5%-10%的HA患者FVIII活性檢測(cè)結(jié)果與臨床出血程度不符，本研究對(duì)1例His99Arg突變患者FVIII:C檢測(cè)結(jié)果差異大及一期法和二期法 FVIII活性檢測(cè)結(jié)果不相符的病人進(jìn)行了分子發(fā)病機(jī)制的研究?；?APTT途徑的一期法和基于發(fā)色底物法途徑的二期法檢測(cè)FVIII活性，發(fā)現(xiàn)先證者一期法（14.7%）與二期法（1.2%）FVIII活性檢測(cè)結(jié)果相差十倍以上。在不同溫度條件

9、（37℃，25℃，4℃，-20℃，-80℃）下，患者血漿 FVIII在較短的時(shí)間內(nèi)活性會(huì)迅速喪失；56℃熱變性分析顯示突變蛋白重鏈和輕鏈解離速度比正常人快3倍左右。F8基因分析發(fā)現(xiàn)患者存在g.30716 A>G突變而導(dǎo)致His99Arg氨基酸改變。三維結(jié)構(gòu)模型對(duì)FVIII蛋白A1和A3亞基結(jié)合面上疏水作用的分析顯示，His99被A1亞基4個(gè)氨基酸殘基（Ala100，Val101，Tyr105及 His161）側(cè)鏈形成的疏水作用構(gòu)架所包繞