大腸桿菌蘇氨酸脫氨酶變構(gòu)調(diào)控的理性設(shè)計與改造.pdf

1、生物合成型蘇氨酸脫氨酶（TD）是異亮氨酸（Ile）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，受終端產(chǎn)物Ile的反饋抑制及競爭途徑產(chǎn)物纈氨酸（Val）的激活。解除Ile對TD的反饋抑制對Ile生產(chǎn)至關(guān)重要，但是Ile和Val在TD的結(jié)合位點尚不清楚，而這對理性設(shè)計TD構(gòu)建非Ile敏感性突變體是非常必要的。
　　基于大腸桿菌磷酸甘油酸脫氫酶、擬南芥的天冬氨酸激酶1及大腸桿菌TD的ACT-domain結(jié)構(gòu)比對結(jié)果，準確預(yù)測了Ile和Val在TD上可能的結(jié)

2、合位點。根據(jù)氨基酸的保守性選擇了其中的14個氨基酸進行定點突變，并對這些突變體進行了Ile及Val敏感性分析和酶動力學(xué)性質(zhì)研究。研究結(jié)果表明每一個TD單體都有兩個非等價的效應(yīng)物結(jié)合位點：位點A包括殘基R362、E442、G445、A446、R466和H468；位點B包括殘基E347、G350、F352、Y369、I460和S461，都與Ile相互作用，其中E347、G350和F352也參與結(jié)合Val。結(jié)合分子對接結(jié)果，本論文中提議了一種

3、基于變構(gòu)效應(yīng)物Ile和Val濃度控制的調(diào)控機制。
　　根據(jù)結(jié)合位點的研究結(jié)果，理性設(shè)計并構(gòu)建出的5個TD雙位點突變體對Ile敏感性顯著減弱，證明了結(jié)合位點的研究對于理性設(shè)計Ile非敏感型TD突變體具有重要的指導(dǎo)意義。其中，TDR362F/I460F相對于野生型TD對Ile的抗性至少提高了700倍，甚至完全解除了Ile的反饋抑制，且無效應(yīng)物時兩者的酶活水平相當；TDF352A/R362F不僅酶活水平提高，對底物親和力更強，而且對Il

4、e的敏感性減弱非常顯著。在大腸桿菌JW3591中過表達該突變體比過表達野生型TD或TdcB能顯著增加Ile和2-酮丁酸的生產(chǎn)。從酶學(xué)的角度講，TD突變體TDR362F/I460F和TDF352A/R362F對開發(fā)Ile或其他以2-酮丁酸為前體的化合物的高產(chǎn)菌株具有極高的應(yīng)用價值。
　　為了探討TD調(diào)控域作為調(diào)控元件用于蛋白質(zhì)調(diào)控性能改造的可行性，我們將TD的調(diào)控域移植到與TD催化域結(jié)構(gòu)高度相似的生物降解型蘇氨酸脫氨酶（TdcB）上