代謝工程改造大腸桿菌glyA敲除菌株提高L-絲氨酸產(chǎn)量.pdf

1、L-絲氨酸是生物體內(nèi)的重要的中間代謝物，可廣泛的應(yīng)用于食品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域。本文以實驗室已有的敲除編碼絲氨酸脫氨酶基因sdaA，sdaB和tdcG的大腸桿菌工程菌株EJ3為出發(fā)菌株，圍繞L-絲氨酸去路的截斷以及競爭途徑的弱化進行菌株的改造，以提高菌株利用葡萄糖生產(chǎn)L-絲氨酸的能力。在EJ3菌株中過表達甘氨酸裂解系統(tǒng)，蘇氨酸到甘氨酸路徑中的kbl-tdh基因為菌株提供充足的一碳單位，在此基礎(chǔ)上敲除編碼L-絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的基因gl

2、yA，截斷L-絲氨酸的去路；用谷氨酸棒狀桿菌中的serA△197替換大腸桿菌基因組上的serA解除L-絲氨酸的反饋抑制；敲除gpmA、pykF使更多的3-磷酸甘油酸流向L-絲氨酸的合成通路；敲除葡萄糖運輸系統(tǒng)的ptsHIcrr，過表達galP基因以提高L-絲氨酸的得率；最后在大腸桿菌的基因組中插入一個拷貝的編碼L-絲氨酸合成路徑上的酶的基因，使L-絲氨酸的合成路徑更加穩(wěn)定，提高工程菌株生產(chǎn)L-絲氨酸的能力。
　　本文首先在EJ3的

3、基礎(chǔ)上過表達甘氨酸裂解系統(tǒng)，由甘氨酸裂系統(tǒng)提供菌體生長需要的一碳單位，在解決一碳單位供應(yīng)的問題的基礎(chǔ)上成功敲除了glyA，通過過表達kbl-tdh基因解除菌體對甘氨酸的依賴，獲得工程菌株E4G2，該菌株截斷L-絲氨酸的去路，使得L-絲氨酸的產(chǎn)量達到266.3mg/l，菌體的生長狀況與EJ3相差不大。
　　為了徹底解除L-絲氨酸對磷酸甘油酸脫氫酶的抑制，用谷氨酸棒狀桿菌的serA△197替換大腸桿菌基因組上的serA，同時將L-絲氨

4、酸合成途徑中的基因連接到高拷貝組成型質(zhì)粒上，獲得工程菌株E4G5。與E4G2相比，E4G5由于三磷酸甘油酸脫氫酶活性的下降造成其產(chǎn)量較低。
　　為了使更多的前體物流向L-絲氨酸的合成通路，弱化糖酵解途徑中的3-磷酸甘油酸到丙酮酸的代謝通路。gpmA與pykF基因敲除菌G13，與其他菌株相比其葡萄糖的利用能力降低，但更多的3-磷酸甘油酸流向L-絲氨酸的合成路徑， L-絲氨酸的產(chǎn)量達到744.3mg/l。
　　針對葡萄糖的利用效

5、率問題，將葡萄糖運輸系統(tǒng)的ptsHIcrr基因敲除，同時過表達galP基因，利用半乳糖苷透性酶來運輸葡萄糖。獲得的工程菌株G18可產(chǎn)1222.1mg/l的L-絲氨酸，L-絲氨酸的得率顯著提高。
　　高拷貝質(zhì)粒存在不穩(wěn)定的問題，為了彌補該不足，在大腸桿菌工程菌株中插入一個拷貝的編碼L-絲氨酸合成路徑上的相關(guān)基因：pgk-serA△197-serB-serC，獲得工程菌株G23。該菌株在L-絲氨酸的合成能力上有所提高，可產(chǎn)1928.4