硫化氫對(duì)小鼠胃底平滑肌張力的調(diào)控作用及其機(jī)制.pdf

1、硫化氫(H2S)是一種無(wú)色、易燃的酸性氣體，具有明顯的毒性。多年來(lái)的認(rèn)識(shí)主要局限于其毒性作用。但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，而且具有重要的細(xì)胞保護(hù)作用。其主要的合成酶，胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶（cysta-thionine-γ-lyase，CSE）在哺乳動(dòng)物的不同組織內(nèi)廣泛表達(dá)，但是有分布的差異。比如，神經(jīng)細(xì)胞以CBS為主要分布，而心血管系統(tǒng)

2、則主要以CSE為主要分布，在消化道內(nèi)，結(jié)腸、肝臟主要以CSE為要分布。近年來(lái)的研究認(rèn)為，內(nèi)源性的H2S是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種氣體信號(hào)分子，廣泛參與了機(jī)體的多種生理與病理過(guò)程。例如，H2S調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)ATP的生成;此外，H2S通過(guò)激活A(yù)TP敏感的鉀通道調(diào)節(jié)胰島素分泌，參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程;H2S還可以通過(guò)影響ATP敏感的鉀通道在心血管系統(tǒng)以及呼吸系統(tǒng)發(fā)揮作用，尤其H2S在對(duì)抗缺氧缺血引起的心肌損傷中的作用日

3、益受到重視。一方面，H2S激活蛋白激酶C及肌膜ATP敏感鉀通道，保護(hù)大鼠心臟對(duì)缺血-再灌注引起的損傷;另一方面，H2S能促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞增殖、血管的平滑肌細(xì)胞的增殖遷移。
　　在消化道，食物的機(jī)械性消化依賴于消化道的運(yùn)動(dòng)，包括蠕動(dòng)、分節(jié)運(yùn)動(dòng)等運(yùn)動(dòng)形式，而消化道運(yùn)動(dòng)的主體是消化道平滑肌，本身的張力是消化道運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)。消化道平滑肌除了受外來(lái)神經(jīng)、腸神經(jīng)和體液因素調(diào)節(jié)之外，也可以通過(guò)自身調(diào)節(jié)機(jī)制保持其緊張度。例如，細(xì)胞內(nèi)的各種生物活性分

4、子，如H2S、NO等可能是自身調(diào)節(jié)機(jī)制的重要的活性分子。已有研究證實(shí)，胃腸道的黏膜、腸神經(jīng)和平滑肌組織均有CBS和CSE分布，可以產(chǎn)生內(nèi)源性的H2 S;此外，結(jié)腸內(nèi)的細(xì)菌分解消化產(chǎn)物的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生H2S。因此，闡明H2S調(diào)控胃腸道運(yùn)動(dòng)及其機(jī)制具有重要的生理學(xué)以及潛在的臨床意義。
　　本文主要通過(guò)電生理學(xué)以及分子生物學(xué)的方法，研究H2S在小鼠胃底平滑肌運(yùn)動(dòng)調(diào)控中的作用及其機(jī)制。首先，我們研究了H2S對(duì)平滑肌經(jīng)典鈣依賴性收縮途徑——興

5、奮收縮耦聯(lián)的影響:利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了H2S合成酶在小鼠胃平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)情況;采用離體肌條實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H2S對(duì)離體肌條張力的影響;采用細(xì)胞內(nèi)記錄的方法檢測(cè)H2S對(duì)平滑肌細(xì)胞膜電位的影響;采用全細(xì)胞膜片鉗的方法檢測(cè)H2S對(duì)單個(gè)平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鉀通道以及L-型鈣通道電流的影響;采用鈣熒光成像技術(shù)檢測(cè)H2S對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。其次，探討了H2S對(duì)NO生成的影響及其作用機(jī)制:利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)H2S合成酶和NO合成酶在

6、小鼠胃平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)情況;采用電化學(xué)的方法直接檢測(cè)組織內(nèi)H2S和NO的生成情況;采用離體肌條實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H2S和NO對(duì)離體肌條張力的影響;采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)H2S對(duì)NO合成酶活性的調(diào)節(jié)，同時(shí)利用siRNA干擾細(xì)胞內(nèi)H2S生成，檢測(cè)其對(duì)NO合成酶活性的調(diào)節(jié)及其調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　研究結(jié)果如下:
　　一、H2S對(duì)小鼠胃底平滑肌運(yùn)動(dòng)的調(diào)控及其離子機(jī)制
　　1.蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的小鼠胃底平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)H2S合

7、成酶CBS和CSE蛋白。
　　2.離體肌條收縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaHS(H2S供體)可以劑量依賴地增加胃底平滑肌張力;當(dāng)給予CBS阻斷劑AOAA時(shí)，其張力降低，而NaHS可以逆轉(zhuǎn)AOAA的降低張力的作用;SNP(NO供體)降低平滑肌張力，而NOS阻斷劑L-NAME，則其張力升高。然而，CSE阻斷劑PAG，則幾乎不影響其張力的變化。選用電壓依賴性鉀通道特異性阻斷劑4-AP和L-型鈣通道的阻斷劑尼卡地平預(yù)處理，均可以阻斷NaHS對(duì)平滑肌

8、的興奮性作用。
　　3.細(xì)胞內(nèi)記錄結(jié)果顯示，NaHS可以使胃底平滑肌細(xì)胞膜電位發(fā)生去極化。
　　4.全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaHS可以降低電壓依賴性鉀通道的電流，增加L-型鈣通道的電流。
　　5.鈣熒光成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaHS可以增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，而這種增加作用可被L-型鈣通道的阻斷劑尼卡地平阻斷。
　　以上結(jié)果提示:(1)內(nèi)源性的H2S可以增加胃底平滑肌細(xì)胞的張力;(2) H2S降低了電壓依賴性鉀通道

9、電流使細(xì)胞膜去極化，進(jìn)而激活了L-型鈣通道，使鈣離子內(nèi)流增加，最終使得平滑肌張力增加。
　　二、H2S對(duì)小鼠胃底平滑肌NO合成的作用及其機(jī)制
　　1.蛋白免疫印跡的結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的小鼠胃底平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)H2S合成酶CBS和CSE蛋白以及NO合成酶eNOS和nNOS蛋白。
　　2.離體肌條收縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaHS可以增加胃底平滑肌張力，SNP可以降低胃底平滑肌的張力，而NaHS可以部分逆轉(zhuǎn)SNP誘導(dǎo)的平滑肌張力降

10、低作用;HNO可以顯著降低胃底肌條的張力，而作為陰性對(duì)照的KOH對(duì)張力并沒(méi)有顯著性的變化;NO合酶阻斷劑L-NAME可以削弱NaHS誘導(dǎo)的平滑肌張力增加效果。
　　3.電化學(xué)結(jié)果顯示，在胃底平滑肌組織中可以實(shí)時(shí)檢測(cè)到H2S和NO的生成;當(dāng)NO生成量穩(wěn)定后，給予CBS合成酶抑制劑AOAA，可以顯著增加NO的生成效率。
　　4.免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NaHS可以降低eNOS合酶的絲氨酸1177位點(diǎn)的磷酸化水平，降低Akt酶絲

11、氨酸308位點(diǎn)、蘇氨酸473位點(diǎn)的磷酸化水平;PI3K阻斷劑LY294002可以阻斷NaHS降低eNOS合酶的絲氨酸1177位點(diǎn)的磷酸化水平的作用;CBS阻斷劑AOAA可以增加eNOS合酶的絲氨酸1177位點(diǎn)的磷酸化水平，增加Akt酶絲氨酸308位點(diǎn)、蘇氨酸473位點(diǎn)的磷酸化水平;給予CBSsiRNA干擾48小時(shí)之后，eNOS合酶的絲氨酸1177位點(diǎn)的磷酸化水平增加，Akt酶絲氨酸308位點(diǎn)、蘇氨酸473位點(diǎn)的磷酸化水平增加;eNOS蛋

12、白的表達(dá)總量有增加，但Akt激酶的總量未有顯著性變化。
　　以上結(jié)果提示:(1)在胃底平滑肌，H2S和NO的合酶均有表達(dá)，并且可以穩(wěn)定地生成H2S和NO;(2) H2S可以增加胃底的張力，NO降低胃底的張力，H2S通過(guò)PI3K/Akt途徑使eNOS酶活性降低，進(jìn)而增加平滑肌張力。
　　三、結(jié)論
　　以上兩部分的實(shí)驗(yàn)可以歸納為以下幾點(diǎn):
　　1.在小鼠胃底，平滑肌組織可以利用CBS和CSE合酶產(chǎn)生H2S，也可以利用