硫化氫對小鼠腸道cajal間質(zhì)細(xì)胞調(diào)控作用的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、硫化氫(Hydrogen sulfide,H2S)長期以來僅被視為一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體,直到分別在大鼠、人和牛腦中檢測到了內(nèi)源性產(chǎn)生的H2S[1-3],才認(rèn)識到H2S具有一定的生理作用。在哺乳動物體內(nèi),內(nèi)源性H2S主要是通過兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)酶,胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase,CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase,CSE)分解L-半胱氨酸而產(chǎn)生。生理環(huán)境下,它在哺乳動物

2、的血液和組織中的濃度是10-160μM[4-7]。CBS和CSE的分布具有組織特異性,神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要存在CBS,CSE表達(dá)很少[4];在心血管系統(tǒng)如主動脈、肺動脈、腸系膜動脈、尾動脈和門靜脈上有CSE表達(dá)而無CBS分布[5];而回結(jié)腸、肝臟及腎臟則同時(shí)存在有CBS和CSE[8-10]。
　　 內(nèi)源性H2S具有多種生理功能,廣泛參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展過程,被認(rèn)為是繼一氧化氮(Nitric oxide,NO)和一氧化碳(Carbon

3、 monoxide,CO)之后的第三種氣體信號分子。與NO類似,H2S具有雙重作用,如既可以促進(jìn)增殖,又可以抑制增殖[11];在生理濃度時(shí)通過抑制白細(xì)胞活化起抗炎作用,而一旦在炎癥區(qū)域過量時(shí)則起到促炎作用,被看成是炎癥反應(yīng)的一把雙刃劍[12];現(xiàn)在認(rèn)為H2S在各種組織和各種環(huán)境中的作用主要取決于它的局部濃度[6]。以往對H2S的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng),現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它在消化系統(tǒng)的生理作用如舒張平滑肌、保持粘膜完整性、調(diào)控血流量、調(diào)

4、節(jié)炎癥反應(yīng)和鎮(zhèn)痛等[6,9,13,14],但對其在胃腸動力紊亂中的病理生理作用和機(jī)制則了解不多。
　　 Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal,ICC)不僅是胃腸道慢波的起搏細(xì)胞,而且做為神經(jīng)控制肌肉活動的中介,起著調(diào)控胃腸動力的作用。ICC的減少與胃腸動力紊亂性疾病相關(guān),如胃輕癱、慢性特發(fā)性假性腸梗阻、失馳緩癥、慢傳輸型便秘、術(shù)后腸梗阻、炎性腸病等[15]。幾乎所有與ICC減少有關(guān)的胃腸動力

5、紊亂疾病,都伴隨著腸神經(jīng)元的減少[16-19]。對胃腸道超微結(jié)構(gòu)的研究[20,21]也已經(jīng)證實(shí)在腸神經(jīng)元和ICC之間的密切關(guān)系,最近Beckett等[22]在電鏡下觀察到在腸運(yùn)動神經(jīng)元和ICC-IM(intramuscular,肌內(nèi))間形成突觸樣的連接(＜10nm),進(jìn)一步為ICC受神經(jīng)支配的觀點(diǎn)提供了直接證據(jù)。Schicho等[23]報(bào)告在豚鼠和人,超過90％的粘膜下和腸肌層神經(jīng)元共標(biāo)記CBS和ICSE,ICC-MY(myenteri

6、c,肌間)也標(biāo)ECSE。既然NO和CO是ICC的細(xì)胞保護(hù)因子[24],那么H2S和ICC的存活之間有何關(guān)聯(lián)呢?它們是如何影響腸動力的呢?機(jī)制是什么?國內(nèi)外均未見報(bào)道。因此分別通過ICC原代細(xì)胞培養(yǎng)和小鼠小腸切除模型來研究H2S和腸道ICC之間的關(guān)系,旨在探討H2S對腸道ICC的影響及其在術(shù)后腸動力紊亂中的作用。
　　 目的:
　　 1.研究低濃度的H2S(以NaHS為供體)對小鼠腸道ICC原代細(xì)胞培養(yǎng)的增殖作用的影響,證

7、實(shí)低濃度的H2S是否可促進(jìn)ICC的增殖。
　　 2.探討低濃度的H2S促進(jìn)ICC增殖作用的機(jī)制。
　　 3.研究小鼠小腸吻合口近端腸組織H2S生成酶(CSE和CBS)表達(dá)的改變,術(shù)前腹腔注射H2S的供體和CSE抑制劑(NaHS和PPG)對CSE和CBS表達(dá)、ICC網(wǎng)絡(luò)的影響。
　　 方法:
　　 本課題利用原代培養(yǎng)小鼠ICC,在常規(guī)光鏡檢查的基礎(chǔ)上,采用免疫組化方法對原代培養(yǎng)的ICC進(jìn)行鑒定,MTT法測培

8、養(yǎng)的ICC活力,進(jìn)一步采用免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)分析H2S對ICC數(shù)量的影響,采用Western blot法檢測H2S作用后ICC內(nèi)第二信號分子的活化情況;利用腸吻合小鼠模型,RT-PCR法測腸組織CSE/CBS mRNA表達(dá)的差別,分別腹腔注射H2S的供體和CSE抑制劑(NaHS和PPG),檢測CSE/CBS mRNA的表達(dá)、MPO、H2S的生成的變化,并利用免疫熒光染色結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)分析對ICC網(wǎng)絡(luò)的影響。<

9、br>　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組化結(jié)果證實(shí)體外成功分離培養(yǎng)小鼠腸道ICC。
　　 2.在ICC上免疫熒光雙重標(biāo)記c-kit和CD44成功。
　　 3.MTT法證實(shí)低濃度的H2S(以Naris為供體)不影響ICC的活力。
　　 4.激光共聚焦觀察顯示,低濃度的H2S可促進(jìn)ICC的增殖。
　　 5.Westem blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,低濃度的H2S增加p-Akt的表達(dá),P13K(Akt上游信號分

10、子)阻斷劑LY294002能阻斷這一作用,并取消了低濃度的H2S所引起的ICC增殖;低濃度的H2S不增加p-ERK和p-p38的表達(dá)。
　　 6.RT-PCR結(jié)果顯示,小鼠小腸組織表達(dá)CSE mRNA,不表達(dá)CBS mRNA。
　　 7.RT-PCR結(jié)果顯示,在小鼠腸吻合模型中,吻合口近端3cm處CSE mRNA的表達(dá)上調(diào),而近端30cm處CSE mRNA的表達(dá)與假手術(shù)組相比,無明顯差異。
　　 8.RT-PCR

11、結(jié)果顯示,吻合口近端CSE mRNA表達(dá)的上調(diào)有時(shí)間依賴性,CSEmRNA的表達(dá)在術(shù)后1小時(shí)開始增加,術(shù)后6小時(shí)達(dá)峰值,而后逐漸下降,至術(shù)后24小時(shí),與假手術(shù)組無明顯差異。
　　 9.RT-PCR結(jié)果顯示,分別給手術(shù)組和假手術(shù)組小鼠腹腔注射H2S的供體和CSE抑制劑(NaHS和PPG)及生理赫水(作為對照),其中假手術(shù)組小鼠、手術(shù)組小鼠之間吻合口近端30cm處的CSE mRNA表達(dá)、MPO、H2S的生成沒有差別;而手術(shù)組小鼠之間

12、吻合口近端3cm處的CSE mRNA表達(dá)、MPO、H2S的生成有明顯差別,手術(shù)+NS組最高,其次是手術(shù)+NaHS組,手術(shù)+PPG組CSE mRNA的表達(dá)最低。免疫熒光染色分析結(jié)果顯示手術(shù)+NS組ICC平均陽性面積百分比在手術(shù)組小鼠之間在吻合口近端3cm處顯著低于手術(shù)+PPG組。
　　 結(jié)論:
　　 1.低生理濃度的H2S(以Naris為供體)不影響ICC的細(xì)胞活力,可促進(jìn)ICC增殖。
　　 2.低生理濃度H2S的