硫化氫對(duì)小鼠SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、硫化氫是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號(hào)分子。研究表明,硫化氫具有重要的生物學(xué)功能,參與體內(nèi)多個(gè)病理生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),硫化氫發(fā)揮神經(jīng)調(diào)質(zhì)樣作用,能夠調(diào)節(jié)NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)傳導(dǎo),易化長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)形成。但是,硫化氫是否影響神經(jīng)再生,這方面的研究報(bào)道較少。因此,本研究主要探討硫化氫是否影響小鼠 SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化及其信號(hào)機(jī)制,為揭示硫化氫的神經(jīng)生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:研究硫化氫對(duì)小鼠S

2、VZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖及分化的影響,并探討相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法:(1)分離C57BL小鼠胚胎(E13-14)SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球傳代貼壁培養(yǎng)2次后用于實(shí)驗(yàn);干細(xì)胞表面標(biāo)記物nestin及Sox2免疫熒光共染鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。(2)免疫熒光結(jié)合western blot及反轉(zhuǎn)錄PCR的方法鑒定胚胎神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)硫化氫內(nèi)源性合成酶胱硫醚-β-合成酶(cystathionineβ-synthase, CBS)和

3、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase, CSE)的表達(dá),Q-PCR測(cè)定CBS與CSE mRNA的相對(duì)含量;免疫熒光方法鑒定成年C57BL小鼠SVZ區(qū)及胎鼠E14腦組織切片中CBS、CSE及nestin的表達(dá);(3)神經(jīng)球計(jì)數(shù)法檢測(cè)硫化氫供體(NaHS及緩釋劑GYY4137)作用后神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新;Brdu免疫熒光染色法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖;免疫熒光方法標(biāo)記神經(jīng)元標(biāo)記物Tuj-1與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP,檢

4、測(cè)硫化氫供體作用后神經(jīng)干細(xì)胞的分化;MTT方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的存活率;Caspase-3免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡;反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA水平的影響;采用western blot測(cè)定CREB的磷酸化水平。
　　結(jié)果:(1)免疫熒光方法標(biāo)記約99％的體外培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物nestin及Sox2,說(shuō)明成功分離培養(yǎng)純度較高的胚胎神經(jīng)干細(xì)胞,可以用于本研究。(2)免疫熒光法檢測(cè)顯示,在成年C57BL小鼠

5、SVZ區(qū)、胎鼠E14腦組織切片及體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)CBS均有較高含量的表達(dá),RT-PCR及western blot進(jìn)一步驗(yàn)證了CBS的表達(dá);免疫熒光方法、PCR及western blot檢測(cè)到胎鼠E14腦組織切片及體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)CSE的表達(dá),但在成年的C57BL小鼠SVZ區(qū)未檢測(cè)到CSE的陽(yáng)性表達(dá);Q-PCR法提示體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)CBS mRNA水平約是CSE的3倍。(3)神經(jīng)球計(jì)數(shù)法及Brdu免疫熒光染色顯示硫化氫供

6、體可促進(jìn)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。在體實(shí)驗(yàn)也表明硫化氫供體NaHS在一定劑量范圍內(nèi),呈劑量依賴性地促進(jìn)SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。體外分化實(shí)驗(yàn)顯示硫化氫可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化。MTT法顯示,硫化氫供體NaHS對(duì)細(xì)胞活力沒(méi)有影響。Caspase-3免疫熒光染色表明,外源性硫化氫不影響神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。此外,NaHS呈濃度依賴性的升高星形膠質(zhì)細(xì)胞中膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA的表達(dá)。Western blot顯示NaHS不改變神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)