Wnt-β-catenin信號通路在TGF-β1誘導的真皮成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉化中作用和機制的研究.pdf

1、【研究背景】
　　增生性瘢痕是皮膚組織損傷后，創(chuàng)面愈合中過度纖維化的產(chǎn)物。肌成纖維細胞由成纖維細胞經(jīng)表型轉化而來，是導致增生性瘢痕形成的主要效應細胞。研究表明，TGF-β1是誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞表型轉化的關鍵刺激因素。TGF-β1除由經(jīng)典的Smad分子介導其下游信號傳導外，還與Wnt信號通路存在交互調(diào)控機制，共同參與多種生理病理過程。Wnt信號是調(diào)控器官和組織發(fā)育、干細胞分化的重要信號通路，已有報道提示它可能參與了創(chuàng)面愈合

2、、纖維化疾病的發(fā)生、纖維化效應細胞的激活，但是具體作用可能存在組織器官特異性，潛在分子機制不明。特別是Wnt信號在真皮成纖維細胞表型轉化中的作用，及其與TGF-β1信號的交互調(diào)控作用如何，尚不明確。
　　【研究目的】
　　1.明確增生性瘢痕組織及瘢痕成纖維細胞中，Wnt通路關鍵信號分子的表達調(diào)控機制。
　　2.明確外源調(diào)控Wnt信號對TGF-β1誘導的真皮成纖維細胞表型轉化的具體作用，并初步探討其作用機制。
　　

3、【研究內(nèi)容】
　　1.采用實時熒光定量PCR方法，對增生性瘢痕組織和瘢痕成纖維細胞中Wnt通路相關分子的表達進行檢測。
　　2.用TGF-β1誘導正常真皮成纖維細胞表型轉化，采用實時熒光定量PCR和免疫印跡法，分別檢測成纖維細胞轉化過程中Wnt通路關鍵信號分子的表達變化。
　　3.使用SB216763活化Wnt通路，采用實時熒光定量PCR、免疫印跡、細胞免疫熒光等方法，檢測成纖維細胞表型轉化標志分子表達特性的變化；用成

4、纖維細胞三維凝膠收縮實驗檢測成纖維細胞收縮功能的改變。
　　4.構建β-catenin過表達載體，合成siRNA片段。
　　5.轉染β-catenin過表達載體或siRNA片段，用實時熒光定量PCR、免疫印跡、細胞免疫熒光等方法，檢測成纖維細胞表型轉化標志分子表達特性的改變。
　　6.用Wnt通路激活劑和轉染β-catenin過表達載體的方法干預增生性瘢痕成纖維細胞，實時熒光定量PCR和免疫印跡法檢測α-SMA、Ⅰ/Ⅲ

5、型膠原、TGF-β1、Smad3、Smad7的表達變化。
　　7.用重組Wnt細胞因子干預成纖維細胞，觀察其對成纖維細胞表型轉化的作用。
　　【研究結果】
　　1.與自體正常皮膚相比，增生性瘢痕組織中Wnt2、Wnt3a、Wnt4、Wnt10b的表達水平顯著下調(diào)。同樣，與正常真皮成纖維細胞相比，增生性瘢痕成纖維細胞中Wnt2、Wnt4、Wnt10b的表達水平也顯著下調(diào)。
　　2.正常成纖維細胞經(jīng)TGF-β1誘導轉

6、分化過程中，Wnt2、Wnt4、Wnt10b的mRNA水平均顯著上調(diào)。TGF-β1對β-catenin的mRNA水平?jīng)]有明顯的影響，但可以顯著上調(diào)其蛋白表達水平。
　　3.用Wnt/β-catenin激活劑SB216763與TGF-β1共同作用于正常成纖維細胞后，TGF-β1誘導的α-SMA，Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達被顯著抑制；細胞免疫熒光結果顯示，α-SMA陽性的肌成纖維細胞數(shù)量顯著減少。三維凝膠收縮實驗顯示，SB216763作用后，

7、成纖維細胞的收縮功能被顯著抑制。
　　4.成功構建了β-catenin真核表達載體，合成siRNA片段。
　　5.β-catenin過表達載體轉染成纖維細胞后，顯著抑制了TGF-β1誘導的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達；細胞免疫熒光顯示，β-catenin轉染后，α-SMA陽性的肌成纖維細胞數(shù)量顯著減少；而β-catenin表達被抑制后，TGF-β1誘導的α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達水平進一步上調(diào)。
　　6.SB21

8、6763和β-catenin過表達干預增生性瘢痕成纖維細胞后，α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達被顯著抑制；TGF-β1和Smad3的mRNA水平被SB216763下調(diào)，而Smad7表達水平未出現(xiàn)顯著變化。
　　7.Wnt4作用于成纖維細胞，抑制了TGF-β1誘導的α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達；抑制TGF-β1的自分泌機制；還能使肌成纖維細胞發(fā)生逆分化。
　　【研究結論】
　　1.真皮成纖維細胞表型轉化中，TGF-β1可

9、能通過上調(diào)Wnt2、Wnt4、Wnt10b這些Wnt配體分子，激活Wnt/β-catenin信號通路，直接在蛋白水平活化β-catenin。
　　2.外源活化Wnt/β-catenin可以抑制TGF-β1誘導的真皮成纖維細胞表型轉化，對TGF-β1誘導的成纖維細胞表型轉化起負反饋調(diào)控作用。
　　3.外源激活Wnt/β-catenin信號，可抑制增生性瘢痕成纖維細胞中α-SMA和Ⅰ/Ⅲ型膠原的表達。
　　4.Wnt/β-