血管緊張素-(1-7)在人成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化致氣道重塑中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的：
　　支氣管哮喘（哮喘）氣道重塑涉及免疫、炎癥反應(yīng)及氣道結(jié)構(gòu)改變，并最終導(dǎo)致氣流受限不可逆，氣道阻力增加以及氣道高反應(yīng)性加重，是難治性哮喘的病理基礎(chǔ)。近年來，肌成纖維細(xì)胞（MF）在哮喘氣道重塑中的作用及機(jī)制逐漸成為研究熱點，成纖維細(xì)胞（FB）向MF轉(zhuǎn)化被認(rèn)作哮喘氣道重塑的重要步驟之一。在局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）-血管緊張素II(AngII)-血管緊張素I型受體AT1受體軸可促

2、進(jìn)哮喘膠原蛋白形成。而與該軸相拮抗的RAS新分支— ACE2-Ang-(1-7)-Mas軸是否能夠有效抑制FB向MF轉(zhuǎn)化，并下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1），α-平滑肌動蛋白（α-SMA）以及I型膠原蛋白（Col-I）等關(guān)鍵蛋白的水平，進(jìn)而減輕哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展，然而其作用及具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬通過探討Ang-(1-7)在FB向MF轉(zhuǎn)化過程及其在氣道重塑中的作用，尋找相關(guān)的作用通路，從分子和細(xì)胞水平上揭示ACE2-A

3、ng-(1-7)-Mas軸與 MF致氣道重塑的關(guān)系，為進(jìn)一步研究哮喘氣道重塑的機(jī)制，減輕氣道重塑的治療提供新的方向。
　　方法：
　　1.觀察AngⅡ在促進(jìn)人肺成纖維細(xì)胞（Human lung fibroblast,HLF）向MF轉(zhuǎn)化過程中刺激局部RAS各組分表達(dá)情況，通過Western Blot方法檢測不同濃度AngⅡ在不同時間觀察點上RAS各組分及氣道重塑相關(guān)重要蛋白（TGF-β1、α-SMA以及Col-I）的表達(dá)情況，

4、明確AngⅡ最適宜刺激濃度以及最佳觀測時間。
　　2.在AngII誘導(dǎo)的HLF向MF轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型中，觀察Ang-(1-7)對于TGF-β1、α-SMA以及Col-I表達(dá)的影響。實驗設(shè)計中將觀察組分為四組：
　　①空白對照組；
　?、趩渭傾ngII刺激組；
　　③AngII+Ang-(1-7)聯(lián)合刺激組；
　　④AngII+ Ang-(1-7)+A779共培養(yǎng)組，通過Real time-PCR、Western

5、 blot方法觀察不同組別α-SMA、TGF-β1以及Col-I蛋白表達(dá)以及mRNA轉(zhuǎn)錄的差異，觀察Ang-(1-7)特異性Mas受體阻斷劑A779對α-SMA、TGF-β1和Col-I表達(dá)的影響。
　　3.在AngII誘導(dǎo)的HLF向MF轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型中，觀察Ang-(1-7)抑制HLF向MF轉(zhuǎn)化的相關(guān)信號通路，設(shè)立四個觀察比較組，通過Western blot方法觀察Ang-(1-7)對于p38 MAPK、PI3K、AKT、Smad

6、2/3，JNK及ERK等信號分子磷酸化的影響。給予A779后，觀察Ang-(1-7)對上述信號分子的效應(yīng)是否發(fā)生改變。
　　結(jié)果：
　　1.明確10-6mmol/l Ang II為最佳刺激濃度，而48小時作為最佳觀測時間；AngⅡ在促進(jìn)HLF向MF轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)局部RAS系統(tǒng)表達(dá)失衡，ACE及AT1R表達(dá)增高，ACE2表達(dá)降低（所有 P均<0.05）；AngⅡ可促進(jìn)α-SMA、TGF-β1、Col-I蛋白表達(dá)顯著增多（所有P

7、均<0.05）。
　　2.在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)兩個水平上，Ang-(1-7)均能有效降低經(jīng)Ang II刺激后α-SMA、TGF-β1及Col-I表達(dá)（所有P均<0.05）；給予Mas受體拮抗劑A779干預(yù)后，α-SMA、TGF-β1及Col-I表達(dá)則較AngII+Ang-(1-7)聯(lián)合刺激組有所增加（所有P均<0.05）。
　　3.經(jīng)Ang II刺激后，TGF-β1/Smad2/3蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05），而p3

8、8 MAPK、PI3K、AKT、JNK及ERK等磷酸化也顯著增加（所有P均<0.05），但ERK及AKT變化程度顯著低于p38、PI3K以及JNK。給予Ang-(1-7)干預(yù)后，p38 MAPK、PI3K以及JNK等信號分子的磷酸化顯著降低，而這一效應(yīng)同樣可以為A779所拮抗（所有P均<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Ang II和Ang-(1-7)均參與HLF-MF轉(zhuǎn)化過程，二者作用相互拮抗；
　　2.Ang-(1