人源抗-CTGF單鏈抗體的制備及其在抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中作用的研究.pdf

1、背景：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，是導(dǎo)致肺纖維化的關(guān)鍵因子。阻斷CTGF可能是治療肺纖維化的有效方法。
　　目的：制備抗結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單鏈抗體(scFv)，研究其住抑制肺纖維化形成和發(fā)展中的作用，探索其對(duì)肺成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響以及可能的信號(hào)通路，初步闡明其作用機(jī)制。
　　方法：使用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑⑶捌跇?gòu)建的質(zhì)粒pET32a-TrxA-His-scFv-His突變?yōu)閜ET32a-TrxA-

2、scFv-His并將之轉(zhuǎn)化到E.coli.BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白TrxA-scFv-His，經(jīng)過凝血酶酶切及兩次鎳柱親和層析得到抗CTGF單鏈抗體蛋白，SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度，ELISA檢驗(yàn)其免疫學(xué)活性。使用TGF-β1與制備的scFv共同干預(yù)人胚肺成纖維細(xì)胞，通過RT-PCR、免疫熒光實(shí)驗(yàn)及Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組人胚腫成纖維細(xì)胞中的α-SMA的表達(dá)水平。Western Blot檢

3、測(cè)scFv對(duì)HELF的D-Akt的影響。
　　結(jié)果：SDS-PAGE電泳顯示經(jīng)過親和層析得到的抗CTGF單鏈抗體純度在95％以上，ELISA實(shí)驗(yàn)表明抗其能夠CTGF特異性結(jié)合，RT-PCR、Western Blot及免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示TGF-β1對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞的α-SMA上調(diào)表達(dá)作用能夠被抗CTGF單鏈抗體所抑制。Western Blot結(jié)果顯示抗CTGF單鏈抗體可抑制人胚肺成纖維細(xì)胞的Akt的磷酸化。
　　結(jié)論：我們制備