版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、低氧應(yīng)激是應(yīng)激的重要形式之一。為適應(yīng)低氧環(huán)境、進(jìn)行自我保護(hù),機(jī)體形成了在不同氧環(huán)境下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin-releasinghormone,CRH)家族在機(jī)體低氧應(yīng)激過程中通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamuspituitaryadrenal,HPA)軸、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能,參與調(diào)節(jié)機(jī)體的低氧應(yīng)激過程,進(jìn)而穩(wěn)定機(jī)體內(nèi)環(huán)境。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放
2、激素1型受體(Corticotropinreleasinghormonereceptor1,CRHR1)介導(dǎo)CRH生理作用的發(fā)揮,其基因表達(dá)調(diào)控是應(yīng)激誘導(dǎo)HPA軸反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)低氧應(yīng)激激活HPA軸,誘導(dǎo)大鼠等動(dòng)物腦不同部位以及腺垂體CRHR1mRNA表達(dá)上調(diào),提示低氧下轉(zhuǎn)錄因子可能通過與其作用元件結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控CRHR1mRNA的表達(dá)。本研究旨在探討低氧應(yīng)激下NF-κB和AP-1參與CRHR1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的機(jī)制
3、。
研究方法
將大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-2161~+347段不同長(zhǎng)度DNA序列亞克隆入不含啟動(dòng)子的螢光素酶載體pGL3中,構(gòu)建各種質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染AtT20細(xì)胞,檢測(cè)其活性與內(nèi)參pRL-TK螢光素酶活性比值;利用整體間歇低氧應(yīng)激動(dòng)物模型,研究低氧誘導(dǎo)大鼠垂體CRHR1基因表達(dá)變化;應(yīng)用EMSA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在體外與靶序列結(jié)合活性;應(yīng)用定量RealtimePCR方法檢測(cè)整體水平CRHR1mRNA的表達(dá)。<
4、br> 研究結(jié)果如下:
1.獲得大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-2161~+347段DNA序列,全長(zhǎng)為2508bp,經(jīng)過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該序列分別含有5個(gè)c-jun/AP-1,3個(gè)GR,4個(gè)NF-κB以及8個(gè)HIF-1結(jié)合位點(diǎn)。
2.成功構(gòu)建質(zhì)粒p2161-18T和p2161Luc,分別用于測(cè)序和檢測(cè)CRHR1基因5’端調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件在CRHR1基因5'調(diào)控區(qū)-2161~+3
5、47段的分布,又分別構(gòu)建了p1833Luc、p1795Luc、p1692Luc、p1289Luc、p1248Luc、p1218Luc、p1140Luc、p838Luc、p687Luc、p360Luc等系列缺失體質(zhì)粒。進(jìn)一步構(gòu)建了含-809~-800位點(diǎn)的NF-κB結(jié)合元件的突變體質(zhì)粒p838mLuc和含有-1277~1271位點(diǎn)的c-jun/AP-1結(jié)合元件的突變體質(zhì)粒p1289mLuc和以及c-jun的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-c
6、-jun。
3.發(fā)現(xiàn)p2161Luc、p1289Luc、p838Luc在AtT20細(xì)胞中的活性隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì),在24小時(shí)達(dá)到最大值。p2161Luc和p1289Luc的活性在低氧暴露8-12小時(shí)期間曲線平緩。
4.發(fā)現(xiàn)低氧暴露24小時(shí),p838Luc在AtT20細(xì)胞中的活性與常氧對(duì)照組相比顯著增強(qiáng),這一現(xiàn)象可以被NF-κB抑制劑(PDTC)抑制;而突變體p838mLuc活性無明顯增強(qiáng)。大鼠垂體
7、CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-809~-800區(qū)域的結(jié)合元件在體外能與AtT20細(xì)胞以及大鼠垂體的核蛋白中的NF-κB結(jié)合,且低氧進(jìn)一步增強(qiáng)二者結(jié)合活性,此結(jié)合可以被PDTC、p65抗體、100倍濃度的冷探針消除;突變探針(-809~-800)不再與NF-κB結(jié)合。在整體低壓艙模擬5km間歇低氧(10.8%O2,4h/d)條件下,CRHR1mRNA表達(dá)表現(xiàn)為一個(gè)先下降后增強(qiáng)的過程,在第2天表達(dá)顯著下降,第5天表達(dá)上升,二者均可被PDTC反轉(zhuǎn)
8、;7km(7.8%O2)連續(xù)低氧8h,CRHR1mRNA表達(dá)下降幅度更大,此結(jié)果同樣可被PDTC反轉(zhuǎn)。
5.發(fā)現(xiàn)大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-1277~1271區(qū)域的結(jié)合元件在體外能與AtT20細(xì)胞核蛋白中的c-jun/AP-1結(jié)合,低氧暴露進(jìn)一步增強(qiáng)二者結(jié)合活性,此結(jié)合可以被c-jun磷酸化抗體、100倍濃度的冷探針消除。突變探針(-1277~1271)不再與c-jun/AP-1結(jié)合。p1289Luc轉(zhuǎn)染AtT20細(xì)
9、胞,低氧暴露24h后,CRHR1基因5'調(diào)控區(qū)-1289~+347段的轉(zhuǎn)錄活性較常氧對(duì)照組增幅達(dá)到最大,此增幅可以被2μgpcDNA3.1-c-jun的共表達(dá)完全抑制。
結(jié)論
1.CRFR1基因5'調(diào)控區(qū)-2161~+347參與低氧上調(diào)CRFR1基因轉(zhuǎn)錄。
2.證明了大鼠垂體CRHR1基因5’調(diào)控區(qū)-809~-800位點(diǎn)的NF-κB結(jié)合元件促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的大鼠垂體CRHR1基因的轉(zhuǎn)錄。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 低氧誘導(dǎo)大鼠腦和垂體CRH,CRHR1和CRHR2基因表達(dá)模式.pdf
- 哮喘患者PBMCs中NF-κB、AP-1變化研究.pdf
- NF-κB參與小鼠Hepcidin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- 高原低氧抑制胰島素分泌的CRHR1調(diào)控機(jī)制.pdf
- 內(nèi)皮素-1、NF-κB及AP-1在高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表達(dá)纖維連接蛋白中的作用.pdf
- MAPK、NF-κB、AP-1的表達(dá)水平和惡性腫瘤陰虛證關(guān)系的研究.pdf
- 小鼠β-防衛(wèi)肽-3(mBD3)基因急性時(shí)相誘導(dǎo)表達(dá)及NF-κB參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié).pdf
- 豬CRHR1、CRHR2基因的克隆及mRNA表達(dá)規(guī)律的研究.pdf
- 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對(duì)AGGF1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf
- 轉(zhuǎn)錄因子NFκB和AP-1在缺血性急性腎功能衰竭發(fā)病中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf
- NMBR介導(dǎo)妊娠子宮平滑肌細(xì)胞中AP-1與NF-κB相互作用的研究.pdf
- 內(nèi)毒素刺激對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB和AP-1活性的影響及其對(duì)TNF-α表達(dá)的調(diào)控作用.pdf
- AP-1對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)大鼠腎系膜細(xì)胞TGF-β-,1-表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及基因治療研究.pdf
- NF-κB參與低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)自體原位肝移植大鼠JNK通路的影響.pdf
- NF-κB誘導(dǎo)的CBS表達(dá)上調(diào)參與糖尿病大鼠機(jī)械痛過敏.pdf
- 熊果酸對(duì)THP1細(xì)胞HMGB1表達(dá)和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的影響.pdf
- 低氧對(duì)三種高原動(dòng)物肺組織ET-1的影響及NF-κB的調(diào)節(jié).pdf
- 中醫(yī)聯(lián)合治療發(fā)作期激素抵抗型哮喘的臨床觀察及對(duì)血漿NF-κB、AP-1表達(dá)水平的影響.pdf
- NF-kappa B和AP-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義的研究.pdf
- NF-κB對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和臨床意義.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論