補(bǔ)精解毒方組分對(duì)肺癌A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB、AP-1的影響.pdf

1、“精氣虧虛、瘀毒內(nèi)留”是肺癌的重要病機(jī)，補(bǔ)精解毒法是肺痛的重要治則。導(dǎo)師章永紅教授根據(jù)補(bǔ)精解毒思想，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立了補(bǔ)精解毒方。前期研究證明補(bǔ)精解毒方具有較好的臨床療效以及較高的抗腫瘤活性。
　　 【目的】基于前期研究基礎(chǔ)，研究補(bǔ)精解毒方組分（冬蟲夏草苷、番荔枝苷）配伍對(duì)肺癌A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-ΚB的影響。
　　 【方法】首先進(jìn)行補(bǔ)精解毒方組分藥物單體（冬蟲夏草苷、番荔枝苷）的提取。四甲基偶氮唑鹽

2、比色法(MTT)檢測(cè)補(bǔ)精解毒方組分對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用。AlinexinV-FITC染色流式細(xì)胞術(shù)、透射電鏡觀察補(bǔ)精解毒方組分對(duì)人肺癌A549細(xì)胞凋亡的作用。WesternBlot檢測(cè)補(bǔ)精解毒方組分作用于肺癌A549細(xì)胞NF-ΚBP65蛋白表達(dá)。電泳遷移率變動(dòng)(EMSA)檢測(cè)補(bǔ)精解毒方組分作用于肺癌A549細(xì)胞的NF-ΚB、AP-1表達(dá)蛋白和DNA的結(jié)合活性。對(duì)肺癌A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pNF-ΚB-1uc、pAP1-1uc報(bào)告基因質(zhì)

3、粒，補(bǔ)精解毒方組分作用后，微孔板發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶值。激光共聚焦顯微鏡觀察補(bǔ)精解毒方組分作用于肺癌A549細(xì)胞NF-ΚB的變化。
　　 【結(jié)果】從補(bǔ)精解毒方組分冬蟲夏草和番荔枝中提取出單體成分：冬蟲夏草苷、番荔枝苷，主要成分為分別為Cordycepin、Bullatacin。MTT法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)：冬蟲夏草苷、番荔枝苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有抑制作用，作用最佳時(shí)間為72h。IC50分別為40.369ug/ml、30.893ug/ml

4、。
　　 補(bǔ)精解毒方組分作用于肺癌A549細(xì)胞后，AlinexinV-FITC染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總凋亡率分別為：補(bǔ)精解毒方59.2％、番荔枝53.2％、冬蟲夏草31.1％。肺癌A549細(xì)胞在補(bǔ)精解毒方作用后，透射電鏡下可以見到核變形、染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞器降解、線粒體腫脹、細(xì)胞質(zhì)腫脹等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　　 Western結(jié)果顯示：補(bǔ)精解毒方組分作用于肺癌A549細(xì)胞后，NF-ΚBp65蛋白表達(dá)增高，陽性灰度積/內(nèi)參值的

5、陽性比分別為：補(bǔ)精解毒方0.862＞番荔枝苷0.656＞冬蟲夏草苷0.574，均大于空白對(duì)照組0.411。
　　 EMSA結(jié)果表明：補(bǔ)精解毒方組分作用于肺癌A549細(xì)胞后，NF-ΚB、AP-1表達(dá)蛋白與DNA結(jié)合能力增強(qiáng)，各組NF-ΚB的陽性灰度積均值分別為番荔枝233571、冬蟲夏草157870、補(bǔ)精解毒方242437.5，均大于空白組29897.5。各組AP-1的陽性灰度積均值分別為番荔枝355388、冬蟲夏草244311、

6、補(bǔ)精解毒方318776，均大于空白組84692.5。
　　 微孔板發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶值結(jié)果顯示：補(bǔ)精解毒方組分作用于肺癌A549細(xì)胞后NFΚB、AP-1熒光素酶值明顯升高，與空白對(duì)照組比較具有明顯差異(P＜0.01)。
　　 補(bǔ)精解毒方組分作用肺癌細(xì)胞A549后，激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-ΚB增多，尤其是進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的數(shù)量增多，提示活性增強(qiáng)。
　　 補(bǔ)精解毒方組分對(duì)肺癌細(xì)胞A549作用的強(qiáng)弱順序?yàn)檠a(bǔ)精解