補精解毒方組分對肺癌A549細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB、AP-1的影響.pdf

1、“精氣虧虛、瘀毒內(nèi)留”是肺癌的重要病機，補精解毒法是肺痛的重要治則。導師章永紅教授根據(jù)補精解毒思想，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)立了補精解毒方。前期研究證明補精解毒方具有較好的臨床療效以及較高的抗腫瘤活性。
　　 【目的】基于前期研究基礎(chǔ)，研究補精解毒方組分（冬蟲夏草苷、番荔枝苷）配伍對肺癌A549細胞核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-ΚB的影響。
　　 【方法】首先進行補精解毒方組分藥物單體（冬蟲夏草苷、番荔枝苷）的提取。四甲基偶氮唑鹽

2、比色法(MTT)檢測補精解毒方組分對肺癌A549細胞的抑制作用。AlinexinV-FITC染色流式細胞術(shù)、透射電鏡觀察補精解毒方組分對人肺癌A549細胞凋亡的作用。WesternBlot檢測補精解毒方組分作用于肺癌A549細胞NF-ΚBP65蛋白表達。電泳遷移率變動(EMSA)檢測補精解毒方組分作用于肺癌A549細胞的NF-ΚB、AP-1表達蛋白和DNA的結(jié)合活性。對肺癌A549細胞轉(zhuǎn)染pNF-ΚB-1uc、pAP1-1uc報告基因質(zhì)

3、粒，補精解毒方組分作用后，微孔板發(fā)光儀檢測熒光素酶值。激光共聚焦顯微鏡觀察補精解毒方組分作用于肺癌A549細胞NF-ΚB的變化。
　　 【結(jié)果】從補精解毒方組分冬蟲夏草和番荔枝中提取出單體成分：冬蟲夏草苷、番荔枝苷，主要成分為分別為Cordycepin、Bullatacin。MTT法檢測結(jié)果證實：冬蟲夏草苷、番荔枝苷對肺癌A549細胞具有抑制作用，作用最佳時間為72h。IC50分別為40.369ug/ml、30.893ug/ml

4、。
　　 補精解毒方組分作用于肺癌A549細胞后，AlinexinV-FITC染色流式細胞術(shù)檢測總凋亡率分別為：補精解毒方59.2％、番荔枝53.2％、冬蟲夏草31.1％。肺癌A549細胞在補精解毒方作用后，透射電鏡下可以見到核變形、染色質(zhì)凝聚、細胞器降解、線粒體腫脹、細胞質(zhì)腫脹等典型的細胞凋亡現(xiàn)象。
　　 Western結(jié)果顯示：補精解毒方組分作用于肺癌A549細胞后，NF-ΚBp65蛋白表達增高，陽性灰度積/內(nèi)參值的

5、陽性比分別為：補精解毒方0.862＞番荔枝苷0.656＞冬蟲夏草苷0.574，均大于空白對照組0.411。
　　 EMSA結(jié)果表明：補精解毒方組分作用于肺癌A549細胞后，NF-ΚB、AP-1表達蛋白與DNA結(jié)合能力增強，各組NF-ΚB的陽性灰度積均值分別為番荔枝233571、冬蟲夏草157870、補精解毒方242437.5，均大于空白組29897.5。各組AP-1的陽性灰度積均值分別為番荔枝355388、冬蟲夏草244311、

6、補精解毒方318776，均大于空白組84692.5。
　　 微孔板發(fā)光儀檢測熒光素酶值結(jié)果顯示：補精解毒方組分作用于肺癌A549細胞后NFΚB、AP-1熒光素酶值明顯升高，與空白對照組比較具有明顯差異(P＜0.01)。
　　 補精解毒方組分作用肺癌細胞A549后，激光共聚焦顯微鏡觀察到細胞質(zhì)內(nèi)NF-ΚB增多，尤其是進入細胞核內(nèi)的數(shù)量增多，提示活性增強。
　　 補精解毒方組分對肺癌細胞A549作用的強弱順序為補精解