遺傳改造Zymomonas mobilis代謝木糖及其木糖醇產(chǎn)生機(jī)制的研究.pdf

1、資源和環(huán)境問(wèn)題是人類當(dāng)前面臨的最主要的挑戰(zhàn)。生物資源是地球上最豐富的可再生性資源。隨著礦產(chǎn)資源日漸枯竭，開(kāi)發(fā)高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素類可再生資源的微生物技術(shù)，生產(chǎn)生物燃料，具有極其重要的意義和光明的發(fā)展前景。木質(zhì)纖維素原料轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料酒精是被公認(rèn)為最有發(fā)展前景的可再生清潔能源技術(shù)之一。木糖是繼葡萄糖之后自然界中最豐富的糖分，在木質(zhì)纖維原料水解液中占30％左右。因此，木糖的有效生物轉(zhuǎn)化利用是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵之一。 屬于厭

2、氧型細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是自然界中迄今為止唯一已知的將丙酮酸脫羧酶及乙醇脫氫酶與獨(dú)特的Enter-Doudoroff（ED）糖酵解途徑相偶聯(lián)高效產(chǎn)生乙醇的微生物。它具有酒精產(chǎn)率高、酒精耐受力強(qiáng)、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。但與釀酒酵母相似，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的底物利用范圍有限，除葡萄糖、果糖和蔗糖外，由于自身缺少必要的木糖代謝途徑而無(wú)法利用木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生的木糖等戊糖成分，從而限制了其在酒精發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。雖然

3、之前已有成功地遺傳改造運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌使其代謝利用木糖的研究報(bào)道，但由于所構(gòu)建重組菌大多受專利保護(hù)，且在發(fā)酵過(guò)程中存在著副產(chǎn)物木糖醇抑制、木糖運(yùn)輸速率低、胞內(nèi)能量丟失等問(wèn)題的影響，使其代謝利用木糖產(chǎn)乙醇的效率不是很高。因此本論文擬通過(guò)代謝工程手段改造運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌以獲得能夠代謝利用木糖的重組菌株，并以此為基礎(chǔ)，闡明副產(chǎn)物木糖醇的形成機(jī)制；初步構(gòu)建葡萄糖促擴(kuò)散蛋白介導(dǎo)木糖運(yùn)輸機(jī)制分析及進(jìn)化改造的平臺(tái)，為進(jìn)一步改進(jìn)菌株的木糖發(fā)酵性能奠定基礎(chǔ)。

4、 本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.遺傳改造Z. moblis代謝利用木糖 對(duì)自然界中能夠利用木糖的微生物代謝途徑研究發(fā)現(xiàn)，木糖可通過(guò)磷酸戊糖途徑而與ED途徑相偶聯(lián)，其中木酮糖是磷酸戊糖途徑的一個(gè)重要中間產(chǎn)物。木酮糖可以進(jìn)一步通過(guò)木酮糖激酶、轉(zhuǎn)酮酶和轉(zhuǎn)醛酶的作用而進(jìn)入ED途徑生成酒精。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌正是因?yàn)槿鄙傧嚓P(guān)的磷酸戊糖途徑成分而無(wú)法代謝利用木糖。因此，本文通過(guò)代謝工程手段，將負(fù)責(zé)木糖代謝轉(zhuǎn)化的木糖異構(gòu)酶基因

5、（xylA）和木酮糖激酶基因（xylB）置于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子3-P-甘油醛（Pgap）下；同時(shí)將負(fù)責(zé)木糖轉(zhuǎn)化利用的轉(zhuǎn)醛醇酶（talB）和轉(zhuǎn)酮醇酶基因（tktA）置于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子烯醇酶（Peno）下，通過(guò)電轉(zhuǎn)的方式將上述四個(gè)基因轉(zhuǎn)入到Zymomonas mobilis CP4中，從而在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中構(gòu)建起一套完整的木糖代謝途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌顯示出所有四種酶的活性，由此獲得一株能夠代謝利用木糖的重組菌株Z. mobil

6、is CP4（pBBR-xyl）。 2.重組菌Z mobilis CP4（pBBR-xyl）木糖發(fā)酵測(cè)試 對(duì)構(gòu)建的重組菌Z. mobilis（pBBR-xyl）木糖發(fā)酵能力進(jìn)行了測(cè)試。在3.2％葡萄糖和3.4％木糖（發(fā)酵液中實(shí)際糖濃度）混合碳源條件下發(fā)酵，重組菌最終產(chǎn)生19.5 g/L乙醇。其中，木糖利用率為32.3％，總糖利用率為65.36％，乙醇產(chǎn)率為理論值（以總糖計(jì)算）的57.6％。本論文構(gòu)建的重組菌雖然可能受副

7、產(chǎn)物木糖醇抑制、木糖運(yùn)輸、胞內(nèi)能量等因素的影響不能高效代謝木糖產(chǎn)乙醇，但是具有了代謝利用木糖產(chǎn)乙醇的能力，為進(jìn)一步通過(guò)其它手段包括代謝組學(xué)分析，調(diào)整改進(jìn)細(xì)胞整體代謝流向及能量與氧化還原狀態(tài)平衡，從而改進(jìn)菌株的木糖發(fā)酵性能奠定了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。 3.副產(chǎn)物木糖醇形成機(jī)制的研究 我們通過(guò)HPLC分析發(fā)酵產(chǎn)物時(shí)，在有木糖作為碳源的發(fā)酵液中檢測(cè)到了木糖醇的生成（約1.29 g/L）。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道分析，副產(chǎn)物木糖醇在木酮糖激酶（

8、xylB）的作用下會(huì)生成5-P-木糖醇，而5-P-木糖醇的積累對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有很大的毒害作用。當(dāng)發(fā)酵液中木糖醇的添加濃度達(dá)到5 g/L時(shí)，重組菌的生長(zhǎng)就被完全抑制。因此，木糖醇的形成累積是影響重組菌菌體生長(zhǎng)速率、菌體量和乙醇產(chǎn)量的重要因素之一。但到目前為止，Z. mobilis中木糖醇的產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚。 通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，Z. mobilis中的葡萄糖果糖氧化還原酶（GFOR，廣泛存在于周質(zhì)空間中并催化果糖還原生成山梨醇）介導(dǎo)了木糖

9、還原生成木糖醇的反應(yīng)（產(chǎn)山梨醇vs產(chǎn)木糖醇的比酶活為68.39μmol min-1 mg-1 vs1.102μmol min-1mg-1）。GFOR對(duì)木糖的作用機(jī)制總體上類似于其將果糖還原生成山梨醇的乒乓反應(yīng)機(jī)制，但在某些細(xì)節(jié)上又有所不同：反應(yīng)過(guò)程中，木糖醇的產(chǎn)量隨底物濃度的變化曲線呈現(xiàn)典型的“S”型曲線，并且其協(xié)同系數(shù)為2，遵循正協(xié)同反應(yīng)機(jī)制；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、果糖和木糖競(jìng)爭(zhēng)同一個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)；通過(guò)對(duì)突變體Y269F和S116D的

10、酶活研究發(fā)現(xiàn)，其以葡萄糖和木糖為底物反應(yīng)的變化趨勢(shì)與以葡萄糖和果糖為底物反應(yīng)的變化趨勢(shì)完全一致，由此說(shuō)明GFOR催化木糖還原的分子機(jī)制和催化果糖還原的分子機(jī)制是相同的。GFOR體外催化木糖還原生成木糖醇的發(fā)現(xiàn)，暗示了它是Z.mobilis中木糖醇生成的重要途徑。美國(guó)國(guó)家能源部于2008年11月的相關(guān)申請(qǐng)專利（USPTO patent application：20080286870）從遺傳學(xué)角度發(fā)現(xiàn)木糖醇主要是由GFOR所介導(dǎo)產(chǎn)生的，并且

11、報(bào)道GFOR缺失的重組菌對(duì)木糖的利用率明顯增加，乙醇的產(chǎn)量也顯著提高。通過(guò)本論文的體外研究實(shí)驗(yàn)和美國(guó)國(guó)家能源部的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)，在Z.mobilis中，GFOR是介導(dǎo)木糖醇產(chǎn)生的主要途徑。通過(guò)消除副產(chǎn)物木糖醇的影響，應(yīng)該可以顯著提高重組菌的木糖利用率和乙醇產(chǎn)量。 4.葡萄糖促擴(kuò)散蛋白介導(dǎo)木糖運(yùn)輸機(jī)制分析及進(jìn)化改造平臺(tái)初建 研究發(fā)現(xiàn)，代謝利用木糖的重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中木糖和葡萄糖都是在葡萄糖促擴(kuò)散蛋白（glucose f

12、acilitator protein，GLF）的協(xié)助下，在不需要消耗ATP的條件下以促進(jìn)擴(kuò)散的方式進(jìn)入胞內(nèi)的，但由于GLF對(duì)葡萄糖的親和力（Km=4.1 mM）大于對(duì)木糖的親和力（Km=40 mM），所以在葡萄糖和木糖同時(shí)存在時(shí)，GLF可能會(huì)優(yōu)先運(yùn)輸葡萄糖，待葡萄糖代謝消耗完畢之后才開(kāi)始運(yùn)輸木糖，從而影響木糖的利用速率和乙醇的產(chǎn)率。已知GLF是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌向胞內(nèi)運(yùn)輸糖類的唯一載體，推測(cè)其在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的木糖運(yùn)輸方面也起著重要作用。

13、 本文通過(guò)同源重組將大腸桿菌ZSC112△ptsHI-crr（由于缺少PTS系統(tǒng)相關(guān)酶及葡萄糖激酶而既不能運(yùn)輸也不能磷酸化葡萄糖）中與木糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的xylF、xylG和xylH基因敲除，獲得了一株既不能轉(zhuǎn)運(yùn)利用葡萄糖也不能轉(zhuǎn)運(yùn)利用木糖的缺陷型菌株ZSC112△ptsHI-crr-xylfgh；并進(jìn)一步將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的GLF-GLK（葡萄糖促擴(kuò)散蛋白-葡萄糖激酶）基因轉(zhuǎn)入上述缺陷菌株中，得到的重組菌能重新利用葡萄糖和木糖生長(zhǎng)，這說(shuō)

14、明運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的glf和glk可在功能上彌補(bǔ)大腸桿菌中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)（PTS途徑）的缺陷；此外，在木糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑（xylFGH缺失）被阻斷的情況下，glf能夠彌補(bǔ)大腸桿菌中木糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的缺陷，這直接證明了glf能夠介導(dǎo)木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)。由此我們得到了一株葡萄糖和木糖代謝缺陷型的ZSC112△ptsHI-crr-xylfgh菌株，并通過(guò)將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的GLF-GLK（葡萄糖促擴(kuò)散蛋白.葡萄糖激酶）基因轉(zhuǎn)入到缺陷菌株從而構(gòu)建了一株便于研究GLF