棉花葉柄高效再生體系的建立與遺傳分析.pdf

1、利用遺傳工程技術(shù)改良棉花品種已經(jīng)取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法是棉花的主要遺傳轉(zhuǎn)化方法之一，然而目前棉花的生物技術(shù)的發(fā)展仍然存在著很多障礙，在棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)中存在體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因犁依賴性、棉花組織培養(yǎng)的低效性(耗時(shí)，耗工)、基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性(難重復(fù)，轉(zhuǎn)化率低)和轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀的變異等等，這些問(wèn)題已經(jīng)成為棉花生物技術(shù)、棉花功能基因的驗(yàn)證和棉花相關(guān)基因克隆等研究領(lǐng)域的障礙和瓶頸。本研究針對(duì)棉花組織培養(yǎng)中涉

2、及的主要問(wèn)題，從棉花組織培養(yǎng)外植體的選擇、基因型限制的遺傳規(guī)律、適合組織培養(yǎng)的特種棉花材料選育等方面進(jìn)行初步研究，同時(shí)把棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的遺傳轉(zhuǎn)化效率提高了2～3倍，轉(zhuǎn)基因周期縮短到6個(gè)月，轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定在30％，為棉花功能基因的快速鑒定與轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)造提供了技術(shù)支撐。取得的主要研究結(jié)果如下： 大田葉柄組織培養(yǎng)體系的建立：通過(guò)大田棉株葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)、胚性愈傷組織的分化、胚狀體的萌發(fā)等試驗(yàn)，建立了CCRI24的葉柄組織培養(yǎng)體系

3、，與常用的無(wú)菌苗下胚軸組織培養(yǎng)體系相比，該體系培養(yǎng)周期和分化率均無(wú)顯著差異，其分化率穩(wěn)定在30％左右。同時(shí)解決了葉柄組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織難以分化為胚性愈傷組織、胚性愈傷組織比來(lái)源于無(wú)菌苗下胚軸的胚性愈傷組織更容易褐化的問(wèn)題。①激素對(duì)褐化有一定的影響，調(diào)節(jié)激素的用量，也可以達(dá)到早出胚狀體的目的KT/6-BA組合中，6-BA的用量應(yīng)介于0.08～0.16mg·L-1之間較好，KT的用量在0.08～0.12mg.L-1效果較好；在KT/IA

4、A組合中，KT在0.08-0.12mg·L-1時(shí)，IAA用量在0.08～0.12mg.L-1正常胚狀體的比例較高；②培養(yǎng)基中氮源的配比是棉花新分化的胚性愈傷組織在繼代中出現(xiàn)褐化的主要原因，將MS培養(yǎng)基大量元素中KNO3的用量增加到3.04g·L-1，NH4NO3減少到0.66g·L-1有利于防止褐化。 棉花葉柄愈傷組織分化率的遺傳分析：通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，葉柄分化率分布符合正態(tài)分布，說(shuō)明葉柄分化率受數(shù)量基因控制。利用主-多基因模型分析

5、發(fā)現(xiàn)：大田棉花葉柄的分化率主要受2對(duì)主基因控制?；蜷g存在加性、顯性、上位性，該性狀主基因遺傳率在74.68％～83.22％。說(shuō)明利用育種手段可以選育出高分化率的材料。在控制分化率的基因中，也存在多基因效應(yīng)，多基因解釋的遺傳變異低，僅有10.47-16.78％。 葉柄分化率相關(guān)基因的QTLs定位：通過(guò)W10xTM-1組合的F2群體分子標(biāo)記，找到了27個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，采用Mapmaker/Exp(Version3.0)數(shù)據(jù)分析軟件構(gòu)

6、建連鎖群，進(jìn)行分子標(biāo)記的連鎖群分析與位點(diǎn)排序，對(duì)檢測(cè)到的19個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，有12個(gè)位點(diǎn)進(jìn)入2個(gè)連鎖群(LOD≥3.0)，兩連鎖群分別包含5個(gè)和7個(gè)分子標(biāo)記。根據(jù)連鎖群長(zhǎng)度從大到小順序?qū)Ω鬟B鎖群進(jìn)行命名為L(zhǎng)G1、LG2，LG1連鎖群長(zhǎng)度為194.3cM，LG2連鎖群長(zhǎng)度為109.1cM，標(biāo)記間的最小遺傳距離為12.7cM，最大的遺傳距離為43.3cM。應(yīng)用復(fù)合區(qū)間作圖法共檢測(cè)到3個(gè)與分化率相關(guān)性狀的QTL(LOD≥2.5)，分布在2個(gè)連

7、鎖群上，解析8.4％～58.1％的表型變異。其中，1個(gè)貢獻(xiàn)率達(dá)到58.1％。另兩個(gè)貢獻(xiàn)率分別為14.4％和8.4％。 棉花葉柄組織培養(yǎng)特性：棉花不同部位的葉柄細(xì)胞在脫分化形成愈傷組織方面無(wú)顯著差異；在棉花植株生長(zhǎng)發(fā)育的旺盛時(shí)期，即蕾期、盛蕾期、開(kāi)花期、盛花期，植株不同部位、不同發(fā)育時(shí)期的葉柄愈傷組織的生長(zhǎng)速度有一定的差異；胚性愈傷組織分化率沒(méi)有顯著差異。到了棉花生長(zhǎng)發(fā)育的后期，隨著葉柄的衰老程度增加，誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)發(fā)生改變

8、，生長(zhǎng)緩慢，但仍有42.8％的分化率。說(shuō)明葉柄是比較適合組織培養(yǎng)的外植體。 棉花葉柄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立：葉柄和無(wú)菌苗下胚軸對(duì)卡那霉素的耐受性不同，在用作遺傳轉(zhuǎn)化外植體時(shí)抗生素篩選濃度不同，農(nóng)桿菌浸染和適宜抗生素篩選條件下，抗性愈傷組織的誘導(dǎo)率分別是84.3％和46.7％，而兩者抗性愈傷組織分化率分別是65.1％和71.8％，因此葉柄轉(zhuǎn)化率是51.8％，無(wú)菌苗下胚軸的轉(zhuǎn)化率是33.5％，利用葉柄作外植體的轉(zhuǎn)化效率是無(wú)菌苗下胚軸的1

9、.55倍。葉柄抗性愈傷組織誘導(dǎo)率高的原因也可能與葉柄橫截面面積大，與農(nóng)桿菌接觸的細(xì)胞多有關(guān)。 棉花高分化率材料的選育體系的建立與遺傳轉(zhuǎn)化：應(yīng)用葉柄組織培養(yǎng)體系，從CCRI24、冀合312、中394中選育出葉柄分化率≥80％的株系10個(gè)，其中有6株系的無(wú)菌苗下胚軸分化率也高達(dá)100％。選育的株系分化能力可以穩(wěn)定的遺傳給后代，解決了棉花組織培養(yǎng)研究中由于分化率不穩(wěn)定而使培養(yǎng)體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。從而建成了一套穩(wěn)定的棉花組織培養(yǎng)體系。