胡蘿卜高效再生體系的建立和內(nèi)參基因的篩選.pdf

1、胡蘿卜（Daucus carrot L.）為傘形科植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一。胡蘿卜是組織培養(yǎng)研究中的經(jīng)典材料，非常適于作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因受體。有關(guān)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的胡蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化體系自1987年以來已有陸續(xù)報道，采取的外植體類型包括子葉、下胚軸、肉質(zhì)根等。本實驗?zāi)康闹皇墙⒁粋€高效率的胡蘿卜再生體系，為下一步構(gòu)建胡蘿卜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，進而通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高胡蘿卜品質(zhì)及品種改良奠定基礎(chǔ)。
　　非生物脅迫是導(dǎo)致胡蘿卜減產(chǎn)

2、的重要因素。基因表達量的檢測是對脅迫相關(guān)基因進行功能研究的一個重要方面。在進行基因表達分析之前，需要對候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評價和驗證。但目前還沒有在非生物脅迫以及激素處理條件下對胡蘿卜內(nèi)參基因進行系統(tǒng)篩選的報道。本實驗的目的是篩選出不同非生物脅迫和不同激素處理條件下最適內(nèi)參基因及其數(shù)目，從而為未來更好地在胡蘿卜基因表達研究中標(biāo)準化和定量分析轉(zhuǎn)錄水平奠定基礎(chǔ)。
　　本試驗建立的高效胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)和再生植株體系，是以胡蘿卜

3、品種‘君川紅’的無菌苗下胚軸為材料，研究不同培養(yǎng)基對其愈傷組織誘導(dǎo)的影響。具體研究結(jié)果如下:
　　胡蘿卜種子在1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)出無菌苗，種子利用20％NaClO消毒45 min效果最好;胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)的過程為暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)時間為30d。篩選所得培養(yǎng)基為B5+0.5 mg/L6-BA+0.8 mg/L2，4-D和B5+1.0 mg/L6-BA+0.6 mg/L2，4-D兩個配比時，愈傷誘導(dǎo)率為百分之百，愈傷分化率最高;將愈傷

4、組織的分化芽切下直接轉(zhuǎn)移到B5培養(yǎng)基上，全部分化芽均能生根并繼續(xù)正常生長;待植株形成根系并長出6～7片葉時，轉(zhuǎn)入玻璃試管中壯苗。壯苗約2周時間，觀察直立、生長旺盛的植株洗去培養(yǎng)基后栽種在裝有土的盆缽中，進行常規(guī)栽培管理，再生苗的成活率較高。
　　本實驗從胡蘿卜品種‘黑田五寸’中克隆出9個候選內(nèi)參基因片段（GAPDH、ACTIN、eIF-4α、PP2A、SAND、TIP41、UBQ、EF-1α和TUB）。8周大的胡蘿卜植株經(jīng)受非生物

5、脅迫（高溫、低溫、鹽害和干旱）和激素處理（赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯和脫落酸）。取處理后植株葉作為實驗材料，用于實時定量PCR。利用BestKeeper、geNorm和NormFinder軟件，對候選內(nèi)參基因3個生物和技術(shù)重復(fù)的qPCR數(shù)據(jù)進行了分析，最終篩選出不同非生物脅迫和不同激素處理條件下最適胡蘿卜內(nèi)參基因。為了進一步驗證在本研究中確定的內(nèi)參基因的適宜性，還對DcDREB-A1基因（擬南芥的AtDREB-A1基因同系物）在胡蘿卜高

6、溫脅迫下的表達譜進行了研究。上述胡蘿卜內(nèi)參基因篩選具體研究結(jié)果如下:
　　1.以胡蘿卜品種‘黑田五寸’葉cDNA為模板，對9個候選內(nèi)參基因（GAPDH、ACTIN、eIF-4α、PP2A、SAND、TIP41、UBQ、EF-1α和TUB）進行克隆。BLAST分析表明，9個候選內(nèi)參基因與其他物種的同源基因堿基相似性大部分在80％以上。內(nèi)參基因的高度保守性進一步表明實驗結(jié)果是準確的。
　　2.單脅迫處理:ACTIN和TUB，并在

7、eIF-4α或者SAND中選取1個基因，是高溫脅迫下最佳內(nèi)參基因組合;ACTIN或GAPDH中選取1個基因，與UBQ是低溫脅迫下最佳內(nèi)參基因組合;ACTIN與TUB或GAPDH被推薦為干旱脅迫處理下最適內(nèi)參基因組合;GAPDH與eIF-4α和UBQ選為赤霉素脅迫下最佳內(nèi)參基因組合;GAPDH、eIF-4α、PP2A、SAND、UBQ和EF-1α為茉莉酸甲酯處理下最適內(nèi)參基因組合;GAPDH、ACTIN、eIF-4α、TIP41和EF-1

8、α為水楊酸處理下的最適內(nèi)參基因組合，可以對目的基因進行精確的標(biāo)準化。
　　3.處理組合:ACTIN、UBQ、EF-1α爭TUB被選作“非生物脅迫”組的最佳內(nèi)參基因組合;eIF-4α、GAPDH、 ACTIN乖TUB被選為“激素處理”組的最佳內(nèi)參基因組合;ACTIN和TUB，可以選擇作為“總”組的最適內(nèi)參基因組合。
　　4.綜合分析，在胡蘿卜葉片中，ACTIN和TUB為所有樣本組合中最穩(wěn)定的基因，但單脅迫下其穩(wěn)定性排名有較大變