降鈣素對(duì)大鼠膝OA模型軟骨退變和軟骨下骨破骨吸收的影響.pdf

1、目的：
　　 改良Hulth法制作大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型，評(píng)價(jià)造模的有效性；在有效的模型中，分析關(guān)節(jié)軟骨和滑膜基質(zhì)金屬蛋白酶的變化特點(diǎn)；研究降鈣素(Calcitonin，CT)對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨、滑膜及軟骨下骨改變的影響，探討CT對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，以及對(duì)軟骨下骨骨吸收的抑制作用。
　　 方法：
　　 105只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(ACLT+MMx)、降鈣素(CT)干預(yù)組和假手術(shù)組(Sham)，每組各35只。
　

2、　 (1)改良Hulth法行骨關(guān)節(jié)炎(OA)造模，對(duì)照組(ACLT+MMx)：前交叉韌帶橫斷和內(nèi)側(cè)半月板切除；Sham組：打開關(guān)節(jié)腔，不切斷交叉韌帶和切除半月板；CT組：造模術(shù)后第二天始行降鈣素15IU/kg隔日皮下注射，對(duì)照組和sham組注射等量的生理鹽水。在造模1w、2w、4w、6w、8w、12w處死大鼠。膝關(guān)節(jié)標(biāo)本肉眼大體觀察，取股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨，脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)軟骨下骨及關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜作為組織標(biāo)本，HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、Masson染

3、色。以Mankin評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，增加Masson染色的結(jié)果評(píng)分，對(duì)OA的病程進(jìn)行分期。
　　 (2)取軟骨和滑膜標(biāo)本，軟骨標(biāo)本來自股骨內(nèi)側(cè)髁。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本經(jīng)處理后，液氮保存，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)Sox9、Ⅱ型膠原、MMP-1、-3、-13的蛋白含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimePCR)檢測(cè)Sox9、Ⅱ型膠原、MMP-1、-3、-13基因表達(dá)的變化，分析OA基質(zhì)金屬蛋白酶的變化特點(diǎn)及降鈣素干預(yù)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨的

4、保護(hù)作用。
　　 (3)取各期脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)標(biāo)本，研磨后提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimePCR)檢測(cè)RANK和組織蛋白酶K(CK)表達(dá)量的變化，分析降鈣素對(duì)OA早期軟骨下骨骨吸收的影響。同時(shí)通過HE染色切片計(jì)數(shù)軟骨下骨骨小梁的體積、數(shù)目、分離度，比較OA造模后2w和12w時(shí)骨小梁的差異。
　　 結(jié)果：
　　 (1)大體及組織觀察
　　 對(duì)照組：造模2w關(guān)節(jié)軟骨失去光澤，色暗，HE染色軟骨細(xì)胞

5、數(shù)量輕度增生；4w見軟骨破壞，細(xì)胞數(shù)量增多，Masson染色紅染，少許藍(lán)色出現(xiàn)；6w軟骨潰瘍破壞明顯，骨贅增生，細(xì)胞排列紊亂，Masson染色紅藍(lán)相間；8w軟骨缺損，骨贅增生明顯，有軟骨細(xì)胞壞死；12w可見軟骨下骨外露，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。CT組：病理改變時(shí)期延后2w。Sham組大體和組織切片接近正常。
　　 (2)ELISA測(cè)定和RealtimePCR
　　 對(duì)照組和sham組比較：軟骨MMP-1：顯著上調(diào)(P＜0．Ol

6、)，組內(nèi)變化呈下調(diào)趨勢(shì)(P＜0.01);MMP-3：顯著上調(diào)(P＜0.01)，組內(nèi)變化呈上調(diào)趨勢(shì)(P＜0.05);MMP-13:顯著上調(diào)(P＜0.01)，病程進(jìn)展呈上調(diào)趨勢(shì)(P＜0.01)?；ぶ蠱MP-1、-3、-13表達(dá)高于sham組，呈上升趨勢(shì)(P＜0.01)。
　　 CT組與對(duì)照組比較：Sox9的表達(dá)上調(diào)，變化有差異(P＜0.05)；Ⅱ型膠原在OA造模前4w，表達(dá)下調(diào)，6w起上調(diào)表達(dá)，變化有顯著差異(P＜0.01);MM

7、P-1、-13的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.01);MMP-3在OA早期(2w)是上調(diào)表現(xiàn)(P＜0.01),中晚期是下調(diào)(P＜0.01)；CK的表達(dá)下調(diào)(P＜0.01);RANK的表達(dá)在OA早期是下調(diào)(P＜0.01)。
　　 (3)骨組織計(jì)量學(xué)參數(shù)變化
　　 對(duì)照組和sham組比較：2w時(shí)，骨小梁的體積和骨小梁數(shù)目顯著小于sham組，骨小梁分離度大于sham組(P＜0.01)，軟骨下骨體積和數(shù)目減少，間距增加。12w時(shí)骨小梁體

8、積、骨小梁數(shù)目均高于sham組，骨小梁分離度小于sham組(P＜0.01)。
　　 CT組與對(duì)照組比較：2w時(shí)，骨小梁的體積和骨小梁數(shù)目均高于對(duì)照組，骨小梁分離度小于對(duì)照組(P＜O.01);12w時(shí)沒有顯著差異(P＞0.05)。Sham和Sham+CT組沒有差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．改良Hulth法制作大鼠OA模型，即橫斷前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，是一種較為實(shí)用有效的膝關(guān)節(jié)OA模型制作方法。M

9、ankin評(píng)分能基本反映OA的早、中、晚分期，Masson染色可以作為Mankin評(píng)分的補(bǔ)充。
　　 2．引發(fā)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的MMPs分泌有時(shí)相性。軟骨細(xì)胞MMP-1、-13在OA早期是高表達(dá)，而MMP-3的表達(dá)則是早期低表達(dá)，中晚期高表達(dá)。
　　 3．滑膜在OA的發(fā)生過程中扮演重要的角色。早期即有降解軟骨的作用，而不僅僅是繼發(fā)的滑膜炎。
　　 4.CT促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨形成和抑制軟骨基質(zhì)的降解。
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