降鈣素基因相關(guān)肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨分化和骨吸收功能影響的實驗研究.pdf

1、在臨床上我們發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷（如截癱或者顱腦損傷）的患者若同時伴有四肢長骨骨折時，常常在骨折區(qū)出現(xiàn)大量骨痂的過度生長，嚴重的甚至出現(xiàn)異位骨化，其骨折愈合的速度也快于不伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的四肢長骨骨折患者；相反的若是骨折患者同時伴有明顯周圍神經(jīng)損傷時，骨折愈合的過程將出現(xiàn)明顯的延長，延遲愈合甚至是骨不愈合的可能增高。大量文獻表明中樞神經(jīng)受到損傷后，神經(jīng)肽類物質(zhì)在外周血液中的濃度升高，這可能是導致骨痂過度生長的重要原因；這些神經(jīng)肽類物質(zhì)

2、其中就包括降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)和P物質(zhì)等。降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是一種體內(nèi)廣泛分布的神經(jīng)肽，研究發(fā)現(xiàn)其具有促成骨的作用，但是CGRP對骨吸收中破骨前體細胞即骨髓源性巨噬細胞(BMMs)的是否具有調(diào)控作用尚不清楚。因此我們課題組設(shè)計了相應(yīng)實驗，來探究CGRP對SD大鼠骨髓源性巨噬細胞（BMMs)破骨分化和骨吸收功能的影響，闡明其影響骨代謝的分子機制，為骨修復(fù)和骨重建提供新的思路。
　　實驗一降鈣素基因相關(guān)肽對大鼠骨髓源

3、性巨噬細胞破骨分化的影響
　　目的：研究降鈣素基因相關(guān)肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨分化的影響。
　　方法：（1）采用差速貼壁的方法分離出SD大鼠骨髓源性巨噬細胞，原代培養(yǎng)并傳代，而后加入適當濃度的sRANKL和M-CSF，進行大鼠破骨前體細胞的破骨分化誘導。（2）實驗分組：A:空白對照組（不含CGRP）；B：高劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-7mol/L）；C：中劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-8mol/L）

4、；D：低劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-9mol/L）。（3）加入不同濃度CGRP后破骨分化誘導培養(yǎng)7天，通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色法（TRAP染色）觀察破骨細胞形態(tài)并對成熟的破骨細胞進行計數(shù)分析。(4)加入不同濃度CGRP后破骨分化誘導7天，通過RT-PCR方法檢測破骨分化特異性特基因（RANK、TRAP、NFATc1）mRNA的表達。（5）對加入不同濃度CGRP破骨分化誘導7天后的破骨細胞進行處理，通過Western-blo

5、t檢測破骨特征性TRAP和RANK蛋白的表達。
　　結(jié)果：（1）TRAP染色顯示，相對于空白對照組不同濃度CGPR處理組的成熟破骨細胞數(shù)目顯著減少，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）并且隨CGRP濃度的增高成熟破骨細胞數(shù)減少（P<0.05），組間亦有明顯差異（P<0.05）。（2） RT-PCR檢測破骨分化特異性特基因RANK、TRAP、NFATc1 mRNA和Western-blot測破骨特征性TRAP、RANK蛋白的表達，結(jié)果提示不

6、同濃度CGRP組均明顯低于空白對照組，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：本實驗通過體外骨髓源性巨噬細胞誘導培養(yǎng)破骨細胞的方法，觀察到CGRP具有抑制破骨前體細胞破骨分化的作用，提示CGRP在骨修復(fù)及骨重建中可能發(fā)揮重要的作用。
　　實驗二降鈣素基因相關(guān)肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨誘導后骨吸收功能的影響
　　目的：研究降鈣素基因相關(guān)肽對大鼠骨髓源性巨噬細胞破骨誘導后骨吸收功能的影響。
　　方法：（1）采用

7、差速貼壁的方法分離出SD大鼠骨髓源性巨噬細胞，原代培養(yǎng)并傳代，而后加入適當濃度的sRANKL和M-CSF，進行大鼠破骨前體細胞的破骨分化誘導。（2）實驗分組：A:空白對照組（不含CGRP）;B：高劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-7mol/L）；C：中劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-8mol/L）；D：低劑量CGRP處理組（CGRP濃度為10-9mol/L）。（3）用不含CGRP的破骨誘導液培養(yǎng)骨髓源性巨噬細胞7天后，采用

8、抗酒石酸酸性磷酸酶染色法（TRAP染色）觀察破骨細胞形態(tài)，并對破骨細胞進行鑒別。（4）在不同時間點，通過WST-1法檢測不同濃度CGRP對大鼠破骨前體細胞BMMs增殖率的影響。（5）加入不同濃度CGRP后將破骨前體細胞BMMs破骨分化誘導7天，通過RT-PCR檢測破骨細胞骨吸收功能性基因MMP-9、Cathepsin K mRNA的表達。（6）將BMMs接種于骨磨片上，用含有不同濃度CGRP的破骨誘導液誘導7天后，對骨磨片行甲苯胺藍染色

9、檢測CGRP對破骨細胞的骨吸收功能的影響。
　　結(jié)果：（1）與空白對照組相比，各CGRP處理組對破骨前體細胞BMMs的增殖具有抑制作用，且隨著CGRP濃度的升高，抑制作用更加明顯。（2）RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組相比，CGRP處理組明顯抑制破骨相關(guān)酶MMP-9和Cathepsin K mRNA的表達。（3）甲苯胺藍骨磨片染色顯示，與空白對照組相比，CGRP處理組的骨陷窩數(shù)目明顯減少，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），且CGR