人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨及成軟骨分化中長(zhǎng)鏈非編碼RNA的初步研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的多潛能干細(xì)胞，其具有很強(qiáng)的自我更新和多項(xiàng)分化潛能。在給予適宜的體內(nèi)或體外誘導(dǎo)環(huán)境下，其可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等。間充質(zhì)干細(xì)胞是骨與軟骨組織工程研究常用的種子細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞因獲取和培養(yǎng)簡(jiǎn)單方便，是目前使用最為廣泛、研究最多的間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨、成軟骨定向分化是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，

2、目前其具體的定向分化機(jī)制仍不明了。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。其占到非編碼RNA的80％以上，但卻是目前研究及了解最少的一類RNA。其不具有蛋白編碼功能，但研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在生長(zhǎng)發(fā)育與分化過程中發(fā)揮重要作用。lncRNA具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，參與機(jī)體諸多生物學(xué)行為，并與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治有密切的關(guān)系。然而關(guān)于lncRN

3、A在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成軟骨定向分化過程中的作用尚無系統(tǒng)的報(bào)道和研究。該研究對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化過程中的lncRNAs進(jìn)行了初步篩選，為后續(xù)的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化，為篩選與定向分化有關(guān)的lncRNA提供細(xì)胞樣本。
　　2.利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微陣列芯片技術(shù)分別篩選人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

4、組與未分化組、成軟骨分化組與未分化組之間差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs。
　　3.利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的lncRNA和mRNA進(jìn)行分析，篩選可能參與定向分化過程的lncRNA，預(yù)測(cè)其潛在的生物學(xué)功能。
　　研究方法:
　　1.對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)P3 MSCs分別進(jìn)行成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化，分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。在誘導(dǎo)分化后Day14進(jìn)行細(xì)胞染色及相關(guān)基因的檢測(cè)進(jìn)行誘導(dǎo)分化的驗(yàn)證。

5、　　2.分別取3個(gè)成骨誘導(dǎo)分化、3個(gè)成軟骨誘導(dǎo)分化和3個(gè)正常培養(yǎng)未分化Day14的細(xì)胞樣本作為芯片檢測(cè)樣品，提取細(xì)胞樣本的總RNA。經(jīng)質(zhì)控合格后，利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微陣列芯片技術(shù)對(duì)定向分化組與對(duì)照組之間差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs進(jìn)行篩選。
　　3.通過Gene Ontology、Pathway分析以及構(gòu)建lncRNA和mRNA的共表達(dá)CNC網(wǎng)絡(luò)圖等生物信息學(xué)分析，

6、進(jìn)一步分析差異表達(dá)的lncRNAs，篩選可能與定向分化有關(guān)的lncRNAs，初步探討其生物學(xué)功能。
　　4.采用qRT-PCR對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并檢測(cè)感興趣的相關(guān)的lncRNAs在定向分化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.我們對(duì)MSCs原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在傳代培養(yǎng)至P3時(shí)分別進(jìn)行成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化。我們采用ALP、茜素紅染色及成骨相關(guān)基因ALP、Runx2及ColⅠ的檢測(cè)進(jìn)行成骨分化的鑒定。對(duì)于成

7、軟骨分化，阿利新藍(lán)染色、免疫組化染色(Aggrecan、Sox-9、ColⅡ)以及成軟骨相關(guān)基因Aggrecan、Sox-9、ColⅡ的檢測(cè)均表明了其成功誘導(dǎo)。
　　2.通過對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行初步分析整理，成骨分化組與未分化組間共有1206條lncRNAs差異表達(dá)(FC＞2.0或＜-2.0，P-value＜0.05)，其中差異高表達(dá)的lncRNAs有687條，差異低表達(dá)的519條。另外，差異表達(dá)的mRNAs共2143條，其中上調(diào)表

8、達(dá)的mRNA有957條，下調(diào)表達(dá)的mRNA有1186條。qRT-PCR對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果一致。
　　3.成軟骨分化組與未分化組間共有3638條lncRNAs差異表達(dá)(FC＞2.0或＜-2.0，P-value＜0.05)，其中差異高表達(dá)2166條，差異低表達(dá)1472條。差異表達(dá)的mRNAs共5560條，其中上調(diào)1980條，下調(diào)3580條。qRT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。
　　4.通過GO、Pathwa

9、y分析及CNC網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，對(duì)相關(guān)的lncRNAs進(jìn)行了分析及生物學(xué)功能的預(yù)測(cè)。分別對(duì)lncRNA-H19和uc022axw.1在成骨分化過程中以及l(fā)ncRNA-ZBED3-AS1和CTA-941F9.9在成軟骨分化過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，提示其可能參與MSCs的定向分化過程。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)研究以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化，并進(jìn)行了細(xì)胞染色和分化相關(guān)基因的檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證，

10、為芯片檢測(cè)提供了可靠的細(xì)胞樣本。
　　2.首次系統(tǒng)報(bào)告通過微陣列芯片篩選了入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成軟骨分化與未分化之間間差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs，并通過GO、Pathway分析以及CNC網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建等生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs進(jìn)行分析，初步探討了lncRNA的生物學(xué)作用。
　　3.lncRNAs在MSCs成骨及成軟骨分化過程中存在差異表達(dá)，提示其可能在定向分化過程中的潛在作用。關(guān)于lnc