豬戊型肝炎病毒V1蛋白單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定.pdf

1、戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的急性自限性疾病。其臨床特征為發(fā)熱、全身疲乏、食欲不振、厭油膩、惡心、嘔吐、尿色深黃如濃茶、眼睛和皮膚發(fā)黃，肝功能檢查山現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶迅速升高到幾百甚至幾千單位，黃疸較常見(jiàn)，并可持續(xù)1周。在亞洲、非洲和美洲等發(fā)展中國(guó)家人群中發(fā)生比較普遍，在一些地區(qū)可占到急性病毒性肝炎的50％，是導(dǎo)致發(fā)病和病死的重要因素，尤其對(duì)孕婦可造成有2056的病死率。由于在靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙齒類(lèi)以及各種家禽家畜體內(nèi)也檢測(cè)到HEV抗體，提示其

2、可能為一種人畜共患病。HEV過(guò)去曾被認(rèn)為是一種經(jīng)腸道傳播的非甲-非乙型肝炎病毒。Balagan等用免疫電鏡技術(shù)從一名志愿受試者糞便中觀(guān)察到直徑為27～30nm的病毒樣顆粒，從而證實(shí)該病毒為新型的非甲非乙型肝炎病毒，1989年?yáng)|京國(guó)際會(huì)議正式將這一類(lèi)型的肝炎及其相關(guān)病毒分別命名為戊型肝炎和戊型肝炎病毒。HEV基因組為單股正鏈RNA，約7.5kb，具有3個(gè)開(kāi)放讀碼框(ORF)。病毒基因組的5’端到3’端依次為5’端非編碼區(qū)(5’-NCR)、

3、ORF1、ORF3、ORF2、3’-NCR及polyA尾。HEV全球分布，危害嚴(yán)重。雖然HEV診斷方法不斷得到改進(jìn)，但是安全有效疫苗的研制是控制HEV感染、預(yù)防HE發(fā)生的根本措施。明確HEV抗原表位是開(kāi)發(fā)HEV診斷試劑和研制疫苗的基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外曾就重組蛋白和合成肽對(duì)HEVORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白的免疫原性做了人量研究，發(fā)現(xiàn)在其羧基端集中了具有較強(qiáng)免疫反應(yīng)性的主要抗原表位。ORF2編碼的農(nóng)殼蛋白的上抗原表位數(shù)量多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其富含疏水區(qū)的C端2

4、/3部分存在多個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，包括能誘導(dǎo)中和抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此本研究使用的免疫原是原核表達(dá)的含有swDQ株HEVORF2C端220個(gè)氨基酸殘基的V1蛋白，制備了6株針對(duì)V1蛋白的單抗，而通過(guò)單克隆抗體技術(shù)對(duì)HEV抗原表位進(jìn)行深入研究，不僅有助于了解HEV抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，而且對(duì)該病的診斷以及設(shè)計(jì)安全有效的基因工程表位疫苗等具有重要的意義。 本研究首先構(gòu)建了含swDQ株HEVV1蛋白的原核表達(dá)載體pET32a-V1

5、，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，利用HEV感染豬血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Westernblot分析，證實(shí)表達(dá)的融合蚩白都具有較好的反應(yīng)活性。然后以表達(dá)的融合蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠，最終共獲得了6株針對(duì)V1蛋白的單抗。利用肽掃描技術(shù)對(duì)6株V1蛋白的單克隆抗體(αC11、αC12、γH1、γF8、BC4、CH8)的抗原表位進(jìn)行了研究。將V1蛋白基因分為兩個(gè)相互重疊的基因片段M1和M2，對(duì)6株抗V1蛋白的單抗進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示有3株單抗既能特

6、異性識(shí)別M1又能識(shí)別M2的表達(dá)產(chǎn)物，說(shuō)明這三株單抗所針對(duì)的表位位于M1和M2的重疊區(qū)，即位于ORF2492～500aa(HEVORF2編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的492～500aa)；其余3株單抗中有兩株單抗僅能識(shí)別M1的表達(dá)產(chǎn)物，另外一株單抗僅能識(shí)別M2的表達(dá)產(chǎn)物。將片段M1(386-492aa)和M2(500-606aa)人工合成一套彼此重疊8個(gè)氨基酸長(zhǎng)度為16個(gè)氨基酸的25個(gè)短肽，融合表達(dá)后與MAbs進(jìn)行Westernblot和ELISA

7、反應(yīng)性?huà)呙?，?duì)3株單抗鑒定結(jié)果顯示，一株單抗與融合多肽E4和E5反應(yīng)而不與其他短肽反應(yīng)，說(shuō)明這株單抗所針對(duì)的表位位于E4與E5的重疊區(qū)ORF2418～425aa(HEVORF2編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的418～425aa)；有一株單抗能特異性識(shí)別融合多肽E1而不識(shí)別融合多肽E2，說(shuō)明這株單抗所針對(duì)的表位位于E1與E2的不重疊區(qū)ORF2386～394aa(HEVORF2編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的386～394aa)；另外一株單抗與融合多肽E24和E2

8、5反應(yīng)而不與其他短肽反應(yīng)，說(shuō)明這株單抗所針對(duì)的表位位于E24與E25的重疊區(qū)ORF2588～595aa(HEVORF2編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的588～595aa)。其中，表位418～425aa和表位492～500aa為首次發(fā)現(xiàn)。應(yīng)用純化的表位融合蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，結(jié)果表明4個(gè)融合蛋白均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)短肽的特異性抗體。將純化的表何融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，與抗swDQ株HEV豬血清進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果表明這四個(gè)表