抗鵝細(xì)小病毒NS1蛋白單克隆抗體的制備及其對(duì)應(yīng)抗原表位區(qū)分析.pdf

1、小鵝瘟（Gosling plague，GP）是由細(xì)小病毒科、依賴病毒屬中的鵝細(xì)小病毒（Goose Parvovirus，GPV）引起的一種烈性傳染病。主要侵害4日齡至20日齡內(nèi)的雛鵝和雛番鴨，可以引起急性腸炎及肝、腎、心等實(shí)質(zhì)臟器敗血性病變，尤其以小腸部位的纖維性、栓塞性病變?yōu)橹饕卣?，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)90％以上。目前，此病每年都有不同程度的流行，是養(yǎng)鵝及番鴨地區(qū)最主要的傳染病之一，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于本病長期困擾著養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)

2、展，所以需要一種能夠準(zhǔn)確、簡便的診斷方法來對(duì)該病作出早期診斷。鵝細(xì)小病毒NS1蛋白（GPV-NS1）是鵝細(xì)小病毒的主要非結(jié)構(gòu)蛋白，通過單克隆抗體技術(shù)對(duì)GPV-NS1抗原表位進(jìn)行研究，不僅有助于了解其抗原結(jié)構(gòu)的功能，而且為建立以表位為基礎(chǔ)的抗原抗體診斷方法提供了必要的物質(zhì)材料支持，以期對(duì)該病做出早期的診斷。
　　 本研究首先構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GPV-NS1，同時(shí)構(gòu)建了帶有表達(dá)載體pET30a(+)的重組GPV-N

3、S1，并在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，利用GPV感染鵝的血清（GPV活疫苗毒免疫10周的鵝血清）對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，證實(shí)表達(dá)的融合蛋白具有較好的免疫原性。然后以重組質(zhì)粒pcDNA3.1-GPV-NS1及純化重組蛋白GPV-NS1為抗原，分組免疫4-6周齡Balb/c鼠，免疫三次后，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，利用間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，并初步研究其部分生物學(xué)特性。結(jié)果共獲得6株

4、能穩(wěn)定分泌特異性抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株。單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果顯示，2株為IgG2a型，4株為IgM型，輕鏈均為κ鏈。通過間接免疫熒光顯示，4株單抗均與鵝胚成纖維細(xì)胞表達(dá)的pcDNA3.1-GPV-NS1發(fā)生強(qiáng)熒光信號(hào)，進(jìn)一步證明了單抗的特異性。
　　 Western blot結(jié)果表明，所制備的單抗與重組NS1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。用本實(shí)驗(yàn)室制備保存的15個(gè)相互重疊且覆蓋整個(gè)GPV-NS1截短表達(dá)的重組蛋白，對(duì)抗GPV-NS1的單

5、克隆抗體進(jìn)行Western blot的鑒定，初步證實(shí)了單克隆抗體1B2、3F12和4C6的表位存在于GPV-NS1的498～532aa內(nèi)；3D9的表位存在于485～532aa內(nèi)；2D4的表位存在于485～514aa內(nèi)；3H8的表位存在于543～573aa內(nèi)。鑒定出3個(gè)抗原表位區(qū)，分別位于NS1 485～514aa，498~532aa和543～573aa。
　　 本研究制備了抗GPV-NS1單抗，并對(duì)其相應(yīng)抗原表位區(qū)域進(jìn)行研究，有