丙型肝炎病毒核心抗原單克隆抗體的制備、特征分析及其應(yīng)用.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要病原體之一。丙型肝炎(Hepatitis C)呈世界性分布，全球感染率約為3％，有1.7-2億HCV感染者。HCV基因組為一單股正鏈RNA，約9400個(gè)堿基對(duì)(bp)，由5′及3′末端非編碼區(qū)和一個(gè)大的單一開(kāi)放讀碼框架(ORF)組成。HCV ORF編碼約3011個(gè)氨基酸的病毒前體蛋白，分為結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)。結(jié)構(gòu)區(qū)基因又分為核心區(qū)(C區(qū))和包膜區(qū)(

2、E區(qū))，分別編碼核心蛋白和包膜蛋白(E1和E2)及P7蛋白；非結(jié)構(gòu)區(qū)包括NS2、NS3、NS4和NS5基因，分別編碼NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。目前HCV被劃分為6個(gè)基因型，近100個(gè)基因亞型。由于HCV基因序列存在高度變異性，給丙型肝炎疫苗的研制工作帶來(lái)了極大的困難，因此至今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有效的丙肝疫苗和特效的藥物。
　　HCVcore基因位于ORF第342-914核苷酸(nt)，長(zhǎng)573nt，編碼1

3、91氨基酸(aa)。HCVcore蛋白包括P21和P23兩種表達(dá)形式。P23是由191個(gè)氨基酸殘基組成的完整HCVcore蛋白分子，它只是一種前體蛋白形式，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工，成為由1-174氨基酸殘基序列組成的多肽片段，即成熟的core蛋白形式P21。HCVcore基因保守、抗原性強(qiáng)、具有蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)。core蛋白氨基酸序列上有多個(gè)B、CTL、TH細(xì)胞的抗原表位，能誘導(dǎo)不同病毒株的交叉免疫應(yīng)答。
　　HCV感染已成為全球公認(rèn)

4、的公共健康問(wèn)題，然而至今國(guó)內(nèi)外沒(méi)有一種實(shí)驗(yàn)方法能可靠的區(qū)分HCV感染的急性期和慢性期，這給臨床診斷及治療方案的制定帶來(lái)了困擾。為此，本研究采用HCVcore蛋白作為免疫原，制備抗HCV核心抗原(HCV-cAg)的單克隆抗體(McAbs)，對(duì)制備出的McAbs進(jìn)行鑒定及特征分析；選取效價(jià)高，親和力強(qiáng)的McAbs進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，建立競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，進(jìn)而通過(guò)檢測(cè)急性期丙肝病人、慢性丙肝病人及體檢人群血清，分析急

5、慢性病人血清抑制率的差異，為建立鑒別急、慢性HCV感染的診斷方法奠定基礎(chǔ)。本研究分為兩部分：
　　一、HCV核心抗原單克隆抗體的制備、鑒定及其特征分析
　　首先，用基因1b型HCV-cAg免疫6周齡Balb/c雌性小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接ELISA篩選抗-HCV-cAg陽(yáng)性細(xì)胞孔。陽(yáng)性細(xì)胞孔經(jīng)過(guò)3次亞克隆后，所有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔的培養(yǎng)上清經(jīng)ELISA檢測(cè)，陽(yáng)性率達(dá)到100%，表明雜交瘤細(xì)胞株已單克

6、隆化，即建系。最終獲得4株穩(wěn)定分泌抗-HCV-cAg McAbs的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為：8B10.9G11、3F2和5A11。用其制備小鼠腹水，將所制備的腹水與HCVcore進(jìn)行ELISA反應(yīng)，測(cè)得腹水抗體效價(jià)分別為1:106，1:103，1:103和1:107。通過(guò)Western-blot、間接ELISA法證實(shí)所得到的不同雜交瘤細(xì)胞株分泌的McAbs特異性好，穩(wěn)定性高，均屬于IgGl亞類。通過(guò)硫氰酸鈉(NaSCN)解離試驗(yàn)證明Mc

7、Ab5A11和9G11抗體親和力接近(ED50:2.4M)，且較3F2(ED50:1.9M)，8B10(ED50:1.7M)抗體親和力高。進(jìn)而對(duì)單抗純化并運(yùn)用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記McAb8B10，與McAb9G11、3F2、5A11進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)，結(jié)果顯示McAb8B10與McAb5A11針對(duì)同一抗原表位，而McAb9G11、McAb3F2與McAb8B10針對(duì)不同抗原表位。將4株McAbs與8種不同基因型或亞型的HCV-cA

8、g(分別為1a，2a，2b，3a，3b，4，5，和6型)進(jìn)行Western-blot，結(jié)果顯示4株單抗與不同基因型HCV-cAg的反應(yīng)性存在一定的差異，5A11和3F2與基因型2a、2b、3a、3b、5、6反應(yīng)性良好，與基因型1a和4反應(yīng)較弱；8B10與基因型2a、2b、3a、3b、4、5、6反應(yīng)性良好，與基因型1a反應(yīng)較弱；9G11與基因型2b、3a、3b、4、5、6反應(yīng)性良好，與基因型1a和2a反應(yīng)較弱。
　　二、5A11單克

9、隆抗體在急性期丙肝病人、慢性丙肝病人及HCV抗體陽(yáng)性體檢人群血清檢測(cè)中的應(yīng)用
　　本試驗(yàn)對(duì)純化的McAb5A11進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)了22份急性期丙肝病人、23份慢性丙肝病人及25份HCV抗體陽(yáng)性體檢人群的血清，結(jié)果顯示22份急性期丙肝病人血清有17份(77%)抑制率在40%以下，5份在60%左右；慢性丙肝病人的血清抑制率都在50%以上，其中17份(74%)的抑制率在80-100%之間。25份體檢人

10、群血清只有4份在40%以下，有21份抑制率在40%以上，其中14份(56%)在80%-100%之間。盡管以抑制率40%為標(biāo)準(zhǔn)尚不能完全區(qū)分急、慢性HCV感染，但已能夠鑒別出89%的急、慢性病例。在HCV抗體陽(yáng)性的體檢人群中，抑制率在40%以下的比例只占16%，提示可能已有較多HCV抗體陽(yáng)性的體檢人員已處于慢性HCV感染狀態(tài)。
　　綜上所述，我們運(yùn)用雜交瘤技術(shù)制備出的4株雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗-HCV-cAg McAbs特異性好，穩(wěn)定