NELL-1基因轉(zhuǎn)染的BMSCs和ADSCs成骨向分化能力的比較研究.pdf

1、目的：比較Nel樣I型分子（NELL-1）基因轉(zhuǎn)染后自體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）和脂肪來源干細(xì)胞（rADSCs）的成骨向分化能力。
　　方法:分離大鼠股骨、脛骨骨髓及附睪處脂肪組織，通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法及改良酶組織塊消化法分離獲得原代 BMSCs和ADSCs并進(jìn)行傳代，通過茜素紅染色和油紅 O染色鑒定第三代細(xì)胞的多向分化特性；以脂質(zhì)體為載體，分別搭載NELL-1質(zhì)粒和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）質(zhì)粒作為同種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組

2、和對照組，轉(zhuǎn)染第三代BMSCs和ADSCs；兩種細(xì)胞間，脂質(zhì)體/NELL-1質(zhì)粒復(fù)合物轉(zhuǎn)染的BMSCs和ADSCs互為對照。通過流式細(xì)胞儀測定脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率；采用MTT法檢測NELL-1基因在不同時(shí)間對 BMSCs和ADSCs增殖活性的影響；在成骨誘導(dǎo)條件下，通過堿性磷酸酶（ALP）活性測定、茜素紅染色及Real-time PCR，觀察NELL-1基因?qū)νN干細(xì)胞分化及功能的影響，及兩種細(xì)胞之間成骨向分化能力的比較。

3、　　結(jié)果：
　　1.倒置顯微鏡下觀察原代細(xì)胞貼壁生長，傳代至第三代時(shí)細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣，呈漩渦狀、輻射狀排列，并形成集落；礦化液持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)21天，茜素紅染色后可見細(xì)胞團(tuán)中央橘紅色鈣結(jié)節(jié)形成，成脂誘導(dǎo)28天，油紅O染色觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)亮紅色脂滴形成。
　　2.在脂質(zhì)體/質(zhì)粒質(zhì)量比為4:1時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為：ADSCs：2.86％，BMSCs：1.75％。
　　3.MTT試驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染后

4、第1-3天同種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞增殖情況對比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.RT-PCR結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)第3天、7天，同種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組Runx2、COL1、ALP的mRNA表達(dá)較對照組升高，3天BMSCs中實(shí)驗(yàn)組SP7表達(dá)無明顯改變；兩種細(xì)胞對比，ADSCs成骨因子mRNA表達(dá)水平顯著低于BMSCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。成骨誘導(dǎo)第7天，同種細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)組檢測ALP活性較對照組明顯升高；兩種細(xì)胞對比，ADSCs表達(dá)ALP活性明顯低于BMSCs

5、。成骨誘導(dǎo)第21天在倒置顯微鏡下觀察同種細(xì)胞在同一視野下實(shí)驗(yàn)組鈣結(jié)節(jié)生成數(shù)量較對照組大而多，且定量結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組OD值較對照組大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩種細(xì)胞對比，ADSCs鈣結(jié)節(jié)生成數(shù)量較BMSCs大而多，且定量顯示ADSCs OD值較BMSCs大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo) ADSCs轉(zhuǎn)染效率高于 BMSCs，NELL-1基因能有效促進(jìn)大鼠ADSCs和BMSCs成骨向分化及礦化功能。基因轉(zhuǎn)染后，ADSCs成骨潛能仍不如