Ghrelin通過(guò)MAPK通路誘導(dǎo)兔BMSCs增殖及成骨分化的機(jī)制研究.pdf

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是干細(xì)胞家族的主要成員，其最初在骨髓被發(fā)現(xiàn)，它具有多項(xiàng)功能諸如，分化潛能，造血支持，免疫調(diào)節(jié)等。其增殖和分化為現(xiàn)如今的熱點(diǎn)。在1999年，Ghrelin被日本學(xué)者Kojima等發(fā)現(xiàn)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它是由28個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為3.3KD。Ghrelin是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(Growth hormone secretagogue rec

2、eptor, GHS-R)的內(nèi)源性配體，當(dāng)它與其受體GHS-R結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生具有很強(qiáng)的促進(jìn)生長(zhǎng)激素(Growth hormone, GH)釋放的作用。對(duì)MAPK途徑的研究主要表現(xiàn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的研究，其主要方法是過(guò)表達(dá)、失活、基因沉默等方法。MAPK信號(hào)通路主要有4種類(lèi)型，用它們的核心命名為MAPK。多種生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)均由其參與。每條通路都可以和其它通路相整合交叉，細(xì)胞的命運(yùn)主要由他們的信號(hào)強(qiáng)弱及活化程度決定。
　　目的：本研究就

3、ghrelin對(duì)兔BMSCs（rBMSCs)的增殖與分化的作用，及ghrelin通過(guò)哪種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)兔BMSCs的增殖與分化的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　方法：從健康清潔新西蘭大白兔體內(nèi)分離純化得到rBMSCs。傳代后免疫熒光檢測(cè)rMSCs細(xì)胞標(biāo)記物CD44、CD34的表達(dá)，用MTT檢測(cè)不同代的rMSCs在10天內(nèi)的生長(zhǎng)情況，從而得到最佳的生長(zhǎng)時(shí)間。利用MTT法檢測(cè)不同濃度的Ghrelin對(duì)rMSCs的增殖作用，從而找到ghrelin

4、對(duì)rMSCs的增殖作用的最佳的作用濃度與作用時(shí)間。用western blot的方法來(lái)檢測(cè)Ghrelin對(duì)rMSCs不同時(shí)間點(diǎn)的MAPK通路的關(guān)鍵蛋白（ERK1/2,p38和JNK)的磷酸化情況，來(lái)研究Ghrelin發(fā)揮其作用的主要通路。為了進(jìn)一步研究Ghrelin對(duì)rMSCs增殖的作用，將MAPK通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行抑制，用western blot來(lái)檢測(cè)其下游蛋白的磷酸化情況，及細(xì)胞增殖情況。同時(shí)用ghrelin受體抑制劑作用于細(xì)胞，用w

5、estern blot方法檢MAPK通路的關(guān)鍵蛋白（ERK1/2,p38和JNK)的磷酸化情況，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。同時(shí)用ghrelin對(duì)rBMCs向成骨細(xì)胞分化的影響進(jìn)行研究。用western blot檢測(cè)加入ghrelin后成骨細(xì)胞標(biāo)志因子ALP,Runx2和Osterix的表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)MAPK通路的關(guān)鍵蛋白（ ERK1/2,p38和JNK)的磷酸化情況，來(lái)確定ghrelin對(duì)rBMCs向成骨細(xì)胞分化影響的作用機(jī)制。用

6、MAPK通路的關(guān)鍵蛋白的抑制劑作用于細(xì)胞，及ghrelin受體抑制劑作用于rBMCs向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程，在分別檢測(cè)ALP,Runx2和Osterix的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：由新西蘭大白兔提rMSCs，經(jīng)培養(yǎng)得到較純的細(xì)胞，其在第四代的生長(zhǎng)最佳，且CD44有強(qiáng)烈表達(dá)，而CD34則沒(méi)有表達(dá)。Ghrelin對(duì)rMSCs有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。Ghrelin對(duì)rMSCs的最佳作用濃度為600ng/ml，作用時(shí)間為第三天。用600ng/m

7、l的ghrelin作用于rBMCs并于0,20,40和60min后，磷酸化的ERK1/2的表達(dá)量在ghrelin作用后隨著作用時(shí)間的增加而增加（P<0.05）。且在40min時(shí)達(dá)到量高而后保持不變（P<0.05）。說(shuō)明ghrelin對(duì)rBMCs的作用是通過(guò)ERK1/2通路起作用的。為了進(jìn)一步證明ERK1/2通路的做用，用ERK1/2磷酸化抑制劑U0126作用細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ghrelin對(duì)細(xì)胞的促進(jìn)生長(zhǎng)作用消失。當(dāng)細(xì)胞在600ng/ml Gh

8、relin的作用下，加入ghrelin受體抑制劑，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。從而說(shuō)明在Ghrelin促進(jìn)rMSCs生長(zhǎng)增殖時(shí)也是Ghrelin首先與其受體結(jié)合然后才發(fā)揮的促進(jìn)作用的。在本研究中將ALP,Runx2和Osterix作為rBMSCs向成骨細(xì)胞分化的檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果表明在ghrelin存在的情況下，ALP,Runx2和Osterix的表達(dá)量升高，更有利于rBMSCs向成骨細(xì)胞分化。為了進(jìn)一步研究ghrelin促進(jìn)rBMSCs向成骨細(xì)胞分

9、化的作用機(jī)制，本研究對(duì)MAPK通路的主要蛋白ERK1/2,JNK和p38磷酸化情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明ghrelin促進(jìn)rBMSCs向成骨細(xì)胞分化主要是通過(guò)ERK1/2通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，為了進(jìn)一步證明此機(jī)制，我們用ERK1/2磷酸化抑制劑U0126作用于rBMSCs，結(jié)果表明ERK1/2磷酸化被抑制，而ALP,Runx2和Osterix這三種蛋白的表達(dá)量均顯著下降，且低于只加地塞米松組的表達(dá)量，說(shuō)明rBMSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程減慢。進(jìn)一步

10、證明了ghrelin促進(jìn)rBMSCs向成骨細(xì)胞分化主要是通過(guò)ERK1/2通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為了證明ghrelin促進(jìn)rBMSCs向成骨細(xì)胞分化的實(shí)現(xiàn)是ghrelin先與其受體結(jié)合然后才發(fā)揮其作用的，本研究還用ghrelin受體抑制劑作用于rBMSCs后磷酸化的ERK1/2,JNK,P38的表達(dá)量在不同的時(shí)間段均沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞中ALP,Runx2和Osterix的表達(dá)量也沒(méi)有變化。表明ghrelin的促進(jìn)作用受到抑制。