bFGF基因轉染BMSCs復合珊瑚骨構建下頜髁突的初步研究.pdf

1、下頜髁突骨質缺損是臨床上常遇到的問題,顳下頜關節(jié)骨關節(jié)病、顳下頜關節(jié)強直、髁突腫瘤、髁突損傷、放射性骨髓炎、頜骨發(fā)育不足和畸形等均可造成不同程度的髁突骨質缺損。骨質缺損造成不同程度的顳下頜關節(jié)功能障礙,如咀嚼、語言、吞咽等,影響患者的生活質量。髁突骨質缺損后需進行骨質缺損的修復與重建,以恢復其形態(tài)和功能。目前修復與重建髁突骨質缺損的方法有:自體骨修復重建,人工合成髁突移植和人工顥下頜關節(jié)置換等,這些修復方法雖然有一定的療效,但是亦存在很

2、多不足,目前尚沒有滿意的缺損修復方法,因此,迫切需要尋找理想的治療方法,組織工程學的興起為髁突骨軟骨缺損的修復提供新的治療途徑。
　　 組織工程的基本過程包括種子細胞的選擇和培養(yǎng)、種子細胞與生物材料復合后聯(lián)合培養(yǎng)以及細胞/支架復合體植入體內培養(yǎng)三個步驟。一般認為,組織工程的三大要素包括細胞、信號(細胞因子)和支架材料。特殊的生物活性分子和其他物理因子可驅動細胞增殖、分化、游走和分泌細胞外基質(extracellular matr

3、ix,ECM),間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能夠分化為軟骨和骨細胞使得單細胞來源的MSCs構建組織工程骨軟骨成為可能。支架是組織工程構建的中心,為細胞的增殖和維持分化功能提供必要的支持,而且支架的結構決定了新的組織工程軟骨和骨最終的形態(tài)。
　　 種子細胞的正確選擇是目前組織工程動物實驗及其過渡到臨床的關鍵。目前骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchyma

4、l stem cells,BMSCs)是骨組織工程研究的首選種子細胞,這種細胞在體外增殖能力強,容易在體外分離、培養(yǎng)和擴增；具有多向分化潛能,在適宜的條件下可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、成脂細胞、神經細胞甚至心肌細胞等。但BMSCs也存在純化率較低、干細胞數(shù)量有限、骨髓中干細胞的比例和增殖能力都會隨年齡的增長和骨質疏松的發(fā)生而逐漸下降等缺點。
　　 堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth fac

5、tor,bFGF)是一種能廣泛促進來源于中胚層和神經外胚層細胞(如成纖維細胞、血管內皮細胞、軟骨細胞和神經膠質細胞)增殖的生物活性物質,促進某些體外培養(yǎng)細胞的轉化,在體內可以促進傷口愈合、血管生成、胚胎發(fā)育、肢體再生、神經營養(yǎng)和免疫調節(jié)等。但是細胞因子的局部應用存在一些缺點,如細胞因子半衰期很短,局部出血、軟組織血液循環(huán)可稀釋、帶走細胞因子,人工提取的細胞因子價格昂貴,反復使用產生中毒和免疫反應等。因此現(xiàn)在一些研究通過基因工程技術和組織

6、工程技術相結合,將細胞因子基因轉染細胞,一方面利用移植細胞高效分泌的細胞因子促進骨損傷修復；另一方面移植細胞可增殖、分化,合成細胞外基質,完成修復過程。
　　 為了保持和延長生長因子的生物活性,本研究選擇人BMSCs作為攜帶bFGF基因的種子細胞,采用基因轉染的方法,將bFGF基因轉染到BMSCs,以期獲得穩(wěn)定表達的bFGF。
　　 本研究主要目的:①收取人骨髓細胞,通過密度梯度離心分離法和貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs,

7、并將其分別誘導分化為成骨細胞和成軟骨細胞,探討人骨髓來源MSCs分離、培養(yǎng)和鑒定方法,并探索其誘導條件,為骨組織工程提供種子細胞。②探討作為組織工程種子細胞的骨髓間充質干細胞,在體外培養(yǎng)條件下轉染bFGF基因對其增殖和分化的影響。③將轉染堿性成纖維生長因子基因的人骨髓間充質干細胞與珊瑚骨復合培養(yǎng),體內外觀察轉染堿性成纖維生長因子基因的骨髓間充質干細胞在珊瑚支架材料上生長狀況。④評價采用珊瑚骨復合入骨髓間充質干細胞構建組織工程下頜髁突骨軟

8、骨復合組織的可行性。本研究將為以后進一步探索有效的途徑對髁突骨軟骨組織缺損進行形態(tài)和功能修復,為組織工程組織的臨床應用奠定基礎。
　　 本課題研究內容包括如下五部分:第一部分,人骨髓間充質干細胞體外分離培養(yǎng)及其生物學特性的研究；第二部分,BMSCs體外定向誘導分化的實驗研究；第三部分,骨髓間充質干細胞的bFGF基因轉染與鑒定；第四部分,BMSCs與珊瑚骨復合培養(yǎng)細胞生長狀況:第五部分,BMSCs與珊瑚骨復合構建下頜髁突的動物實驗

9、研究。
　　 第一部分人骨髓間充質細胞體外分離培養(yǎng)及其生物學特性
　　 目的：探討人骨髓來源MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定方法,為骨組織工程提供種子細胞。
　　 材料和方法：從捐贈者髂骨穿刺收取骨髓細胞,采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法進行培養(yǎng)和純化BMSCs,取生長良好的P3或P4代BMSCs進行檢測:①MTT法測定細胞增殖和生長曲線分析；②流式細胞儀檢測BMSCs細胞表面抗原標記和細胞增殖周期；③免疫熒光分析細胞骨架

10、；④細胞染色體核型分析。
　　 結果：①利用密度梯度離心和貼壁篩選的方法分離人BMSCs,經傳代后細胞形態(tài)呈梭形,成纖維細胞樣,均勻一致。②MTT法測定細胞增殖和生長曲線分析結果顯示BMSCs在傳代后經歷游離期、貼壁期、潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期。③流式細胞儀檢測顯示所獲得的BMSCs表面抗原標記高度一致,純度高；表面標記陽性率分別為:CD29(99.0％)、CD44(100％)、CD55(97.1％)和CD71(96.7％)；

11、而一些標記陽性率較低,分別為:CD14(1.9％)、CD34(0.8％)、CD45(4.5％)和CD106(7.7％)；BMSCs細胞周期檢測結果為G0+G1期91.3％、G2期4.1％和S期4.6％,說明大部分細胞仍處于靜止期。⑤微管微絲免疫熒光染色結果顯示,培養(yǎng)的BMSCs具有良好的細胞骨架系統(tǒng)。⑥第7代的BMSCs染色體檢測結果顯示,被測標本有正常染色體數(shù)目(2n=46,XY),且未見染色體異常。
　　 結論：從人骨髓中能

12、分離出高度一致的BMSCs,這些細胞具有正常細胞骨架結構以及正常的人類染色體數(shù)目和形態(tài),可作為骨組織工程的種子細胞。
　　 第二部分骨髓間充質干細胞體外多向誘導分化的實驗研究
　　 目的：探討人骨髓來源MSCs多向分化能力,為骨組織工程提供種子細胞。
　　 材料和方法：取生長良好的P3或P4代BMSCs進行多向誘導分化及相關檢測:①成脂肪誘導分化,蘇丹黑B、油紅O染色檢測；②成骨細胞誘導分化,Vonkossa和茜

13、素紅染色鑒定；③神經細胞誘導分化,甲苯胺藍尼氏和GFAP免疫組化染色鑒定。
　　 結果：①成脂誘導后細胞胞漿內可見脂滴,蘇丹黑B、油紅O染色均呈陽性；②成骨誘導后,Von kossa和茜素紅染色均呈陽性；③神經元樣細胞誘導后,細胞由梭形變?yōu)橛卸鄠€突起的神經元樣細胞,甲苯胺藍尼氏和GFAP免疫組化染色均為陽性。
　　 結論：本實驗分離培養(yǎng)的人BMSCs能夠分化為成脂細胞、成骨細胞和神經元樣細胞,這些細胞具有多向分化能力,可

14、作為骨組織工程的種子細胞。
　　 第三部分骨髓間充質干細胞的bFGF基因轉染與鑒定
　　 目的：探討作為組織工程種子細胞的骨髓間充質干細胞,在體外培養(yǎng)條件下轉染bFGF基因對其生物學特性的影響。
　　 材料與方法：大腸桿菌DH5α(含人pcDNA3.1-bFGF真核表達載體)及大腸桿菌DH5α(含真核表達載體pcDNA3.1)。將DH-5α菌(含人pcDNA3.1-bFGF真核表達載體)擴增,用EndoFree質

15、粒抽提純化試劑盒抽提質粒,并對所提取的pcDNA3.1-bFGF重組表達質粒酶切鑒定和測序。選取生長良好的P2或P3代BMSCs,利用脂質體將pcDNA3.1-bFGF質粒轉染到BMSCs,G418篩選獲得抗性克隆。采用熒光定量PCR、免疫組化、免疫熒光、Western-blot檢測轉染bFGF的骨髓間充質干細胞bFGF基因及其產物的表達,MTT法檢測和流式細胞儀檢測細胞的增殖情況和細胞增殖周期。并將轉染和非轉染BMSCs分別成骨誘導分

16、化,對其堿性磷酸酶活性進行測定。
　　 結果：脂質體介導pcDNA3.1-bFGF重組表達質粒轉染BMSCs,經免疫組化和Western-blot檢測,證實轉染細胞確實表達bFGF,并且表達部位主要在胞漿。轉染細胞增殖活力加強,生長曲線上移,處于增殖周期的細胞比例更高(P<0.05)。堿性磷酸酶活性檢測結果表明轉染細胞的堿性磷酸酶活性高于非轉染細胞(P<0.05)。
　　 結論：用脂質體轉染法能將pcDNA3.1-bFG

17、F重組真核表達載體成功導入體外培養(yǎng)的BMSCs,bFGF基因改良的BMSCs可以改善其生存狀態(tài)和促進其增殖。
　　 第四部分轉染bFGF基因的BMSCs在珊瑚骨表面生長狀況
　　 目的：將轉染堿性成纖維生長因子基因的人骨髓間充質干細胞與珊瑚骨復合培養(yǎng),體內外觀察轉染堿性成纖維生長因子基因的骨髓間充質干細胞在珊瑚支架材料上生長狀況。
　　 材料和方法：珊瑚人工骨:選用海南省淺海灘產石頭狀濱珊瑚為原料,將其制成12

18、mm×8 mm×5 mm的下頜髁突狀。菌株:大腸桿菌DH5α(含人pcDNA3.1-bFGF真核表達載體)及大腸桿菌DH5α(含真核表達載體pcDNA3.1)。選取生長良好的轉染堿性成纖維生長因子基因骨髓間充質干細胞和未轉染的骨髓間充質干細胞各300μl(濃度為4×107細胞/ml)細胞懸液,分別接種于不同珊瑚表面。采用MTT法觀察細胞.支架聯(lián)合培養(yǎng)骨髓間充質干細胞的增殖情況和利用掃描電鏡觀察珊瑚支架上細胞的生長狀況。
　　 結

19、果：MTT法檢測顯示細胞.支架聯(lián)合培養(yǎng)轉染組細胞與聯(lián)合培養(yǎng)未轉染組細胞增殖相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),聯(lián)合培養(yǎng)轉染組細胞生長增殖強于未轉染組細胞。而聯(lián)合培養(yǎng)的未轉染組細胞同單純培養(yǎng)未轉染組細胞增殖相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。掃描電鏡觀察顯示體外培養(yǎng)和植入體內的轉染組細胞和未轉染組骨髓間充質干細胞均貼附在珊瑚上,并在材料上完全鋪展,形態(tài)多樣,隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞向孔內長入或跨越微孔連成網狀或片狀,呈多層生長并且分泌

20、細胞外基質覆蓋于細胞表面。
　　 結論：轉染堿性成纖維生長因子基因的骨髓間充質干細胞在珊瑚支架材料上生長狀況較未轉染組好,珊瑚人工骨不影響骨髓間充質干細胞的增殖,可以作為骨髓間充質干細胞支架材料構建組織工程骨。
　　 第五部分 BMSCs與珊瑚骨復合構建下頜髁突動物實驗研究
　　 目的：評價采用珊瑚骨復合人骨髓間充質干細胞構建組織工程下頜髁突骨軟骨復合組織的可行性。
　　 材料和方法：以多孔的珊瑚骨為材料

21、預制人下頜髁突模型,體外培養(yǎng)擴增人骨髓間充質干細胞,并通過脂質體法將bFGF基因轉染到骨髓間充質干細胞,分別誘導分化為成骨和軟骨細胞。實驗分4組,每組6只:第1組,珊瑚骨表面接種300μl濃度為4×107細胞/ml轉染bFGF基因成骨誘導的骨髓間充質干細胞懸液；第2組,在珊瑚骨表面接種300μl濃度為4×107細胞/ml轉染bFGF基因成骨誘導的BMSCs懸液,然后包被含8×106軟骨細胞(濃度為4×107細胞/ml200μl)的透明質

22、酸凝膠；第3組,珊瑚骨表面接種300μl濃度為4×107細胞/ml骨髓間充質干細胞細胞懸液；第4組,植入單純珊瑚骨支架。體外孵育2天后植入裸鼠背部皮下,6、9和12周后取材,作大體、X線、組織學和免疫組化觀察。
　　 結果：大體和X線觀察髁突形珊瑚骨支架均基本維持最初的形態(tài)。組織學觀察,第1組可見成片的新生骨,新生骨明顯多于第3組,在骨島周圍可見增生的血管。第2組形態(tài)結構與原植入模型支架相似,組織學觀察有骨和軟骨組織結構,骨組織

23、內有新生骨板,并可見軟骨內成骨現(xiàn)象,骨與軟骨排列無序,在骨組織周圍可見較多增生的血管,未見正常髁突骨軟骨結構。免疫組化染色顯示第1和第2組新生骨有Ⅰ型膠原和bFGF表達,軟骨有Ⅱ型膠原和bFGF表達。第3組僅可見散在的的骨島,未見軟骨形成。第4組未見骨和軟骨形成。
　　 結論：利用單一來源轉染bFGF基因的BMSCs分別誘導為成骨和成軟骨細胞,利用珊瑚骨支架和包被透明質酸凝膠,可以在裸鼠體內構建具有骨和軟骨復合結構的人形下頜髁突