miR-210誘導犬BMSCs成血管及成骨向分化的體外實驗研究.pdf

1、目的：應用基因轉染技術，體外檢測 miR210基因誘導犬骨髓間充質干細胞(BMSCs)成骨和成血管方向分化的作用，探索目的基因雙重調控作用，為將來修復骨缺損打下基礎。
　　方法：體外培養(yǎng)骨髓間充質干細胞，流式細胞術檢測 BMSCs表面標志物；構建慢病毒載體 Lenti-miR-210和 Lenti-LacZ，并分別用Lenti-LacZ和 Lenti-miR-210轉染 BMSCs，并在轉染后的3~5d在倒置熒光顯微鏡下觀察病毒轉

2、染效率；應用MTT法檢測病毒對 BMSCs增殖率的影響，并在目的基因轉染 BMSCs的第0天、第1天、第4天、第7天、第14天和第21天分別提取 mRNA和蛋白，利用RT-PCR和 Western blot檢測關鍵性成血管和成骨因子的表達。同時目的基因轉染第21天，通過堿性磷酸酶( ALP)和鈣結節(jié)茜素紅染色觀察體外骨形成的情況。檢測結果均以均數(shù)±標準差表示，使用 SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05為有統(tǒng)計學差異
　　結

3、果：倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)為梭形，旋渦狀生長，流式細胞儀分析顯示，BMSCs間充質干細胞表面抗原 CD44、CD90高度表達，造血干細胞表面抗原 CD34和CD45表達陰性，推斷出所培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞。當感染復數(shù)(MOI)=10時，BMSCs的轉染效率最高，且病毒對 BMSCs增殖能力無顯著影響，在病毒轉染后的5d，倒置熒光顯微鏡觀察，病毒轉染效率均在90％以上， MOI=10時，病毒對細胞的增殖無顯著影響(P＞0.05

4、)；RT-PCR結果顯示，目的基因轉染的第4天、第7天、第14天和第21天，miR-210能夠顯著上調 BMSCs關鍵性成骨和成血管因子的表達(P<0.05)；Western blot檢測結果顯示，蛋白表達與 mRNA的表達趨勢幾乎一致。ALP和茜素紅鈣結節(jié)表達的檢測結果顯示，相較 BMSCs組及Lenti-LacZ/BMSCs組，Lenti-miR-210/BMSCs組 ALP和鈣結節(jié)表達顯著提高。
　　結論：以慢病毒為載體的