舟山眼鏡蛇蛇毒磷脂酶A-,2-的分離及其對(duì)M型膽堿受體的作用.pdf

1、蛇毒成分與生物體內(nèi)的膽堿能系統(tǒng)關(guān)系密切。近年來(lái)，作用于M膽堿受體的蛇毒成分日益受到重視。有學(xué)者從曼巴蛇(Dendroaspis angusticeps)蛇毒分離出一些與M膽堿受體具有高度親和力的單體成分，并稱之為muscarinic toxins(MTs)。MTs對(duì)M1和M4受體亞型具有很強(qiáng)的選擇性，某些MTs已被作為研究M膽堿受體亞型的工具藥加以開發(fā)應(yīng)用；部分MTs還能激動(dòng)M1膽堿受體，可顯著改善動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶障礙，具有開發(fā)成藥物的潛力

2、。有學(xué)者嘗試從曼巴蛇以外蛇種的蛇毒中分離具有M膽堿受體親和力的成分。Miyoshi和Tu分別從眼鏡蛇南洋亞種Naja naja sputatrix和南美響尾蛇Crotalus atrox蛇毒分離獲得與M膽堿受體具有極高度親和力的單體成分，并稱之為mAChR inhibitors(MIs)。但是，MIs與M膽堿受體的親和力遠(yuǎn)強(qiáng)于D.angusticeps蛇毒中MTS；兩種MIs的分子量(分別為13.6 kDa和30kDa)遠(yuǎn)大于MTs(約

3、7kDa)；而且非常有趣的是MIs具有磷脂酶A2活性，是一種蛇毒磷脂酶A2，MTs則無(wú)磷脂酶A2活性。然而，MIs對(duì)M膽堿受體的藥理作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，有待于探索。 蛇毒磷脂酶A2(venom phospholipase A2，vPLA2)在結(jié)構(gòu)和水解功能上與哺乳類動(dòng)物的分泌型磷脂酶A2(secreted PLA2，sPLA2)非常相似。然而，除了具有與哺乳動(dòng)物sPLA2相同水解催化活性之外，vPLA2還具有某些重要的藥理毒性作

4、用。近年來(lái)研究提示，vPLA2的藥理毒理作用可能是通過(guò)與組織中特定的靶蛋白位點(diǎn)特異結(jié)合而產(chǎn)生的。如上所述，MIs是一種vPLA2，與M膽堿受體具有極高的親和力，因此探索其對(duì)M膽堿受體的藥理作用甚為必要。 舟山眼鏡蛇，也稱中華眼鏡蛇(Naja atra)在我國(guó)華南地區(qū)廣泛分布，蛇毒資源豐富，其與N.naja sputatrix蛇種相近。鑒此，本研究首先擬采用色譜層析技術(shù)從舟山眼鏡蛇蛇毒分離純化獲得MIs類的磷脂酶A2；進(jìn)而運(yùn)用放射

5、配體受體結(jié)合法分析該蛇毒單體成分與M膽堿受體的親和力以及對(duì)M膽堿受體亞型的選擇性；接著采用離體器官試驗(yàn)，在M膽堿受體的功能模型上探索該vPLA2的生物學(xué)效應(yīng)以及對(duì)M膽堿受體及其亞型的藥理作用，為其可能的開發(fā)利用(工具藥或治療藥物)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，也有助于加深理解體內(nèi)sPLA2生理與病理生理作用。本研究主要研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)部分： 1.舟山眼鏡蛇蛇毒磷脂酶A2的分離純化及其理化性質(zhì)通過(guò)采用一系列色譜層析分離方法(Seph

6、adex G-50和Sephadex G-150凝膠過(guò)濾色譜、CM-Sepharose Fast Flow離子交換層析色譜及POROS (R)CM4.6/100預(yù)裝柱灌注色譜層析)和運(yùn)用離體生物測(cè)定法篩選活性成分，從舟山眼鏡蛇粗毒中分離純化獲得一種能引起離體豚鼠回腸縱行肌收縮的活性蛋白成分。初步判斷其對(duì)M膽堿受體具有激動(dòng)作用，暫命名為muscarinic protein，簡(jiǎn)稱MP。經(jīng)SDS-PAGE和HPLC鑒定MP的純度達(dá)到電泳純和色

7、譜純水平。質(zhì)譜分析MP的分子量為13.3 kDa，與vPLA2的分子量相似。Edman降解法測(cè)定MP的N端16位氨基酸序列為NLYQFKNMIQCTVPSR，與已發(fā)現(xiàn)的眼鏡蛇vPLA2的序列一致，與其他蛇種的vPLA2具有很高的同源性。以上兩點(diǎn)提示MP很可能是一種vPLA2。通過(guò)磷脂酶A2活性測(cè)定，驗(yàn)證了這一點(diǎn)。小鼠急性毒性試驗(yàn)顯示MP具有致死性，LD50值為14.3mg/kg。 2舟山眼鏡蛇蛇毒磷脂酶A2對(duì)M型膽堿受體的親和力

8、采用放射配體受體結(jié)合法，分析MP對(duì)M型膽堿受體及其亞型的親和力。結(jié)果表明，MP可劑量依賴性地抑制[3H]QNB與大鼠端腦M膽堿受體的結(jié)合反應(yīng)，其IC50值為28.0nmol/L，K1值為10.1nmol/L，提示MP對(duì)大鼠端腦M膽堿受體具有高度親和力，且其親和力明顯大于阿托品和D.angusticeps蛇毒中MT2，與N.naja sputatrix蛇毒中MI相當(dāng)。 分別選用大鼠大腦皮層和大鼠心肌作為M1和ME受體亞型結(jié)合模型，

9、比較MP對(duì)這兩種受體亞型的選擇性。結(jié)果表明，MP可完全抑制[3H]QNB與大鼠大腦皮層或大鼠心肌組織的結(jié)合，并呈劑量依賴性：MP抑制[3H]QNB與大鼠大腦皮層結(jié)合的IC50值為248.8 nmol/L，而抑制[3H]QNB與大鼠心肌結(jié)合的IC50值為22.1 nmol/L，提示MP對(duì)M2亞型的親和力可能大于M1亞型。 3舟山眼鏡蛇蛇毒磷脂酶A2對(duì)M型膽堿受體的藥理作用3.1 MP對(duì)M膽堿受體的作用通過(guò)觀察MP在離體豚鼠回腸縱行

10、肌上的效應(yīng)，研究MP對(duì)M膽堿受體的作用。結(jié)果顯示，MP在豚鼠回腸縱行肌標(biāo)本上可產(chǎn)生劑量依賴性的收縮效應(yīng)，與CCh相似，且該效應(yīng)可被阿托品(2 μmol/L，以上濃度)所拮抗。MP效應(yīng)的EC50值為29.5nmol/L，與CCh(48nmol/L)比較接近，但MP在豚鼠回腸縱行肌標(biāo)本上的最大收縮效應(yīng)約為CCh的43％。提示MP可能對(duì)M膽堿受體具有部分激動(dòng)作用。但是，阿托品阻斷MP的濃度明顯大于阻斷CCh所需的濃度，且高濃度阿托品(0.3和

11、3 μmol/L)只能減小MP的最大效應(yīng)，無(wú)法使MP的量效曲線平行右移，提示阿托品并不是簡(jiǎn)單地競(jìng)爭(zhēng)拮抗MP對(duì)M膽堿受體的作用。 本試驗(yàn)還從神經(jīng)節(jié)、結(jié)合位點(diǎn)及.ACh的釋放等MP有可能作用的幾個(gè)環(huán)節(jié)研究MP在豚鼠回腸上的作用機(jī)制。六烴季銨(100μmoI/L)對(duì)MP在豚鼠回腸縱行肌標(biāo)本上的收縮作用無(wú)明顯影響，提示MP在豚鼠回腸縱行肌標(biāo)本上的作用部位不在上游的神經(jīng)節(jié)，而在效應(yīng)器上。MP(6μmol/L)不影響CCh的量效曲線，提示M

12、P與CCh不是作用于同一位點(diǎn)。MP對(duì)豚鼠回腸縱行肌的作用液可引起蛙腹直肌收縮，提示促進(jìn)ACh的釋放可能與MP收縮豚鼠回腸作用有關(guān)。 本試驗(yàn)還通過(guò)觀察磷脂酶A2抑制劑DEDA和溫度對(duì)MP在豚鼠回腸縱行肌上作用的影響，來(lái)了解MP對(duì)豚鼠回腸縱行肌的作用與其磷脂酶A2活性的關(guān)系。DEDA(100μmol/L)對(duì)MP對(duì)豚鼠回腸縱行肌作用的量效曲線無(wú)明顯影響。27℃和37℃兩種溫度條件下，磷脂酶A2的活性差異較大，而MP對(duì)豚鼠回腸縱行肌的收

13、縮作用無(wú)明顯差異。以上兩點(diǎn)提示MP引起豚鼠回腸縱行肌的收縮效應(yīng)可能不依賴其磷脂酶活性。 3.2 MP對(duì)M1和M2受體的作用與McN-A-343的作用相似，MP幾乎完全抑制電刺激兔輸精管收縮，作用呈劑量依賴性。MP抑制作用的EC50值約為23.7 nmol/L，約為McN-A-343(300 nmol/L)的1/13。提示MP作用的效能與McN-A-343相當(dāng)，效價(jià)為McN-A-343的十幾倍。哌侖西平(0.1μmol/L)可使MP量效曲

14、線平行右移，最大效應(yīng)不變。提示MP抑制電刺激兔輸精管收縮是由M1受體介導(dǎo)的，MP對(duì)M1受體具有激動(dòng)作用。 低劑量MP(2×10-10～2×10-75mol/L)輕微抑制豚鼠心房肌的自律收縮(與CCh相似)，作用只有CCh的20％；麗高劑量MP(2×10-7～2×10-5.5～mol/L)增強(qiáng)豚鼠心房肌的自發(fā)收縮(與阿托品相似)，提示MP可能是M2受體較弱的部分激動(dòng)劑。 3.3蜂毒磷脂酶A2及豬胰磷脂酶A2對(duì)豚鼠回腸縱行肌

15、的作用觀察蜂毒磷脂酶A2和豬胰磷脂酶A2在豚鼠回腸縱行肌的效應(yīng)，了解MP對(duì)M膽堿受體的藥理作用是否磷脂酶A2的一個(gè)共性。 蜂毒磷脂酶A2劑量依賴性收縮豚鼠回腸縱行肌，且可被阿托品(10-6mol/L)部分阻斷，其效應(yīng)的EC50值(24.1nmol/L)，與MP的EC50值(29.5nmol/L)較為接近，為CCh的EC50值(48nmol/L)的1/2，最大效應(yīng)為CCh的50％左右。豬胰磷脂酶A2劑量依賴性地收縮豚鼠回腸縱行肌，

16、且可被阿托品(10-6mol/L)部分阻斷，最大效應(yīng)為CCh的40％左右。以上結(jié)果顯示，這兩種磷脂酶A2對(duì)豚鼠回腸縱行肌的作用與MP相似，提示MP對(duì)M膽堿受體的作用可能是磷脂酶A2的一個(gè)共性。 綜上所述，本研究表明： 1.從舟山眼鏡蛇蛇毒分離純化獲得一種蛇毒磷脂酶A2單體成分，暫命名為muscarinic protein(MP)，其純度達(dá)色譜純，分子量為13.3 kDa，N端16個(gè)氨基酸序列為NLYQFKNMIQCTVP

17、SR，具有磷脂酶A2活性。 2.MP對(duì)M膽堿受體具有高度親和力，其K1值為10.1nmol/L，親和力明顯大于阿托品和Dendroaspis angusticeps蛇毒中MTs，與Naja najasputatrix蛇毒中MI相當(dāng)。MP對(duì)M2受體亞型的親和力大于M1受體亞型，可能具有一定的亞型選擇性。 3.MP可激動(dòng)M膽堿受體，對(duì)M1受體可能具有較強(qiáng)的激動(dòng)作用，而對(duì)M2受體的激動(dòng)作用很弱。 4.MP可致豚鼠回腸平