舟山眼鏡蛇毒細(xì)胞毒素CTX1的純化優(yōu)化及其體內(nèi)抗腫瘤作用研究.pdf

1、背景和目的:
　　蛇毒細(xì)胞毒素(CardiotoxinsCTXs)又稱心臟毒素或者膜毒素,是眼鏡蛇毒中一類重要的活性成分,約占眼鏡蛇毒總蛋白含量的40％左右,它們的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)是高度保守的。CTX1是由日本學(xué)者Hayashi等從臺(tái)灣眼鏡蛇毒中首先分離純化得到的細(xì)胞毒素,是分子量為6697.915Da,等電點(diǎn)為9.0的堿性多肽,分子中含有25個(gè)疏水氨基酸,并含有較多的亮氨酸、賴氨酸,其中的8個(gè)半胱氨酸交聯(lián)成4對二硫鍵。CTX

2、1的分子中的4對二硫鍵聚集成緊密的內(nèi)核像手掌,由此核心區(qū)域伸出的3個(gè)緊鄰的富含折疊的指,形成典型的“三指”狀結(jié)構(gòu),“三指”指端為疏水性氨基酸,指側(cè)則帶有正電荷的精氨酸、賴氨酸,這種三指狀結(jié)構(gòu)有利于其與細(xì)胞膜結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)重新排列,形成孔道,導(dǎo)致細(xì)胞的破碎溶解。本課題組曾經(jīng)用兩種不同方法分離純化得到CTX1。周升銘等用CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析一步法從舟山眼鏡蛇毒粗毒中分離得到CTX1,但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)其中尚有

3、一定的雜蛋白,純度有待提高;崔超偉等采用SephadexG-75凝膠過濾、CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析兩步法雖從舟山眼鏡蛇毒中純化出了純度較高的CTX1,但耗時(shí)較長,對多肽的活性亦有一定的影響。蛇毒細(xì)胞毒素因其廣泛的生物學(xué)活性而受到關(guān)注,本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)蛇毒細(xì)胞毒素CTX1對多種腫瘤細(xì)胞有明顯的體外殺傷作用,如CTX1能抑制人早幼粒白血病細(xì)胞HL-60、人髓性白血病細(xì)胞KG1a、人慢性紅白血病細(xì)胞K562

4、、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、小鼠肝癌細(xì)胞H22、小鼠淋巴白血病細(xì)胞P388的增殖,而且CTX1對正常細(xì)胞毒性作用比較低,如人支氣管上皮細(xì)胞16HBE、小鼠骨髓的單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞。其他學(xué)者的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)蛇毒細(xì)胞毒素對多種小鼠移植性腫瘤都有抑制效果。如蛇毒細(xì)胞毒素CTX-F對小鼠移植性宮頸癌U14、小鼠移植性艾氏腹水瘤、小鼠移植性S180肉瘤、小鼠移植性P388腹水瘤有抑制作用;蛇毒細(xì)胞毒素Ⅻ和蛇毒細(xì)胞毒素XIII對小鼠移植性宮頸癌U14

5、、小鼠移植性艾氏腹水瘤有抑制作用;細(xì)胞毒素P4在體內(nèi)對B6-F10黑素瘤和軟骨肉瘤有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)采用SephadexG-50凝膠層析、CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析兩步法對舟山眼鏡蛇毒進(jìn)行分離純化,通過調(diào)整不同的洗脫流速,以提高其的分離效率及生物活性,為進(jìn)一步研究CTX1的藥理作用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過建立P388白血病小鼠腹水瘤模型,來觀察評(píng)價(jià)CTX1在體內(nèi)的抗腫瘤作用,為將來CTX1的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)研究

6、的依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.舟山眼鏡蛇毒CTX1的純化優(yōu)化及鑒定
　　1.1.分別用7種不同的流速SephadexG-50凝膠層析初步分離眼鏡蛇毒粗毒。
　　1.2.反相高效液相法分析SephadexG-50凝膠層析分離得到的各洗脫樣品。
　　1.3.用3種不同流速的CMSepharoseFastFlow陽離子交換柱層析法進(jìn)一步純化SephadexG-50凝膠層析后的相關(guān)樣品。
　　1.4.反相

7、高效液相法分析CMSepharoseFastFlow離子交換層析法分離得到的相關(guān)樣品。
　　2.用P388腹水瘤模型評(píng)價(jià)CTX1的體內(nèi)抗腫瘤作用
　　2.1.建立小鼠P388腹水瘤模型。
　　2.2.P388腹水瘤小鼠分組尾靜脈注射給藥。
　　2.3.以小鼠的體重、生存期、生命延長率為主要指標(biāo)評(píng)價(jià)CTX1的體內(nèi)抗腫瘤作用。
　　2.4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn),SPSS軟件等統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

8、>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.運(yùn)用SephadexG-50凝膠分離、CM-SepharoseFastFlow陽離子交換層析兩步法對舟山眼鏡蛇毒進(jìn)行分離純化得到純度較高的蛇毒單體CTX1。
　　1.1.用SephadexG-50凝膠分離,流速為1.2、1.8ml/min時(shí)從舟山眼鏡蛇毒粗毒中得到2個(gè)組分,流速為1.3～1.7ml/min時(shí)得到I、II及III3個(gè)組分。經(jīng)反相高效液相色譜檢測得知CTX1主要集中在流速1.3～1.7m

9、l/min洗脫峰的II峰里面。
　　1.2.用CMSepharoseFastFlow陽離子交換層析柱分離SephadexG-50凝膠得到的II峰可得到7個(gè)組份(II1～I(xiàn)I7)。當(dāng)流速為1.4、1.8ml/min時(shí),7個(gè)組分之間分離效果較差;當(dāng)流速為1.6ml/min時(shí),各組分的分離效果比較理想。RP-HPLC分析顯示,組分II5峰為單一成分,純度達(dá)到94.6%;用內(nèi)標(biāo)法顯示,組分II5與CTX1標(biāo)準(zhǔn)品在保留時(shí)間上完全吻合。所以I

10、I5峰就是CTX1目標(biāo)峰。
　　2.建立P388腹水瘤模型評(píng)價(jià)CTX1的體內(nèi)抗腫瘤作用
　　2.1.觀察各組小鼠不同時(shí)間的體重變化,造模第1、3、5、7天各實(shí)驗(yàn)組小鼠體重與生理鹽水陰性對照組小鼠體重比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;第9、11、13天CTX1(20110202)1/10LD50組、CTX1(20110202)1/5LD50組、CTX1(20130419)1/5LD50組、環(huán)磷酰胺組小鼠體重比生理鹽水陰性對照組要小,差異有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義,而9、11、13天CTX1(20110202)1/40LD50組、CTX1(20110202)1/20LD50組小鼠體重與生理鹽水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2觀察各組小鼠生存時(shí)間,與生理鹽水陰性對照組比較,CTX1(20110202)1/40LD50組、CTX1(20110202)1/20LD50組小鼠平均生存時(shí)間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTX1(20110202)1/10LD50組、CTX1(20110202)1/5L

12、D50組、CTX1(20130419)1/5LD50組、環(huán)磷酰胺組小鼠平均生存時(shí)間比生理鹽水陰性對照組要長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTX1樣品(20110202)1/5LD50組小鼠的平均生存時(shí)間比CTX1樣品(20110202)1/10LD50組、1/20LD50組、1/40LD50組小鼠的平均生存時(shí)間要長,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CTX1樣品(20110202)1/10LD50組小鼠的平均生存時(shí)間比CTX1樣品(20110202)1/20L

13、D50組、1/40LD50組小鼠的平均生存時(shí)間要長,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。純度高的CTX1樣品(20130419)1/5LD50組小鼠生存時(shí)間比純度低的CTX1樣品(20110202)1/5LD50組要長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CTX1樣品(20130419)1/5LD50組、CTX1樣品(20110202)1/5LD50組小鼠的平均生存時(shí)間比環(huán)磷酰胺組要長,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3.觀察各組小鼠的肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù),與生理鹽水

14、陰性對照組比較,CTX1樣品(20110202)1/5LD50組、CTX1樣品(20130419)1/5LD50組小鼠的肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。環(huán)磷酰胺組小鼠的肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)均比生理鹽水陰性對照組CTX1樣品(20110202)1/5LD50組、CTX1樣品(20130419)1/5LD50組都要小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.舟山眼鏡蛇原毒通過SephadexG-50凝膠層析,流速為1.6m