豬印記基因的分離、印記鑒定及甲基化分析.pdf

1、印記基因是指基因的表達(dá)具有親本選擇性，即只有父本或母本的等位基因表達(dá)而另一親本的等位基因不表達(dá)或很少表達(dá)的一類基因。對哺乳動(dòng)物的研究表明，印記基因在胎兒、胎盤的生長發(fā)育及胎兒出生后的表現(xiàn)等方面，都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。目前，對基因組印記的研究主要集中在人和小鼠中，在家畜特別是豬中研究比較少。因此，在豬中鑒定印記基因?qū)τ谘芯炕蚪M印記在物種間的保守性和印記基因的功能都具有重要意義。 本研究主要利用大梅、梅大豬及其親本，通過RT-P

2、CR-RFLP分析和PCR產(chǎn)物直接測序法檢測“表達(dá)的SNP”，鑒定了豬4個(gè)候選印記基因的印記狀態(tài)，以期探討基因組印記在豬與其他物種間的保守性；在大白豬×梅山豬F2代群體中，利用PCR-RFLP技術(shù)，對2個(gè)候選印記基因進(jìn)行基因型與重要經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析，以期探討印記基因在育種中作為分子標(biāo)記的可行性；對豬中2個(gè)候選基因中存在的CpG島在各組織中進(jìn)行甲基化分析；利用AMD方法在二月齡大白、梅山、大梅和梅大豬肌肉組織中篩選印記基因，對差異表達(dá)的

3、EST利用“表達(dá)的SNP”進(jìn)行印記驗(yàn)證。主要結(jié)果如下： 1.根據(jù)人和小鼠印記基因的印記狀況及生理功能，篩選ASCL2，NNAT、DIRAS3和DLX5基因作為豬候選印記基因。利用電子克隆和比較基因組學(xué)方法獲得4個(gè)候選印記基因的cDNA序列，均包括完整的開放閱讀框(Openreadingframe，ORF)；(1)ASCL2，獲得cDNA序列1654bp，其中為ORF582bp，GenBank登錄號為DQ666420；(2)NNA

4、T，獲得DNA序列2234bp，GenBank登錄號為DQ666422，該基因包含兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，兩者的區(qū)別在于第二外顯子的有無；(3)DIRAS3，獲得cDNA序列1227bp，開放閱讀框?yàn)?87bp，GenBank登錄號為DQ666421:(4)DLX5，獲得DNA序列4108bp，開放閱讀框?yàn)?87bp，GenBank登錄號為EU168272。豬4個(gè)候選印記基因cDNA序列與人同源序列的相似性均比與鼠同源序列的相似性高，在進(jìn)化關(guān)系上，

5、豬與人相近而與鼠則較遠(yuǎn)。 2.利用大白豬×梅山豬和梅山豬×大白豬正反交模型，通過RT-PCR-RFLP分析和PCR產(chǎn)物直接測序法，鑒定了4個(gè)候選印記基因在二月齡豬13個(gè)組織和器官中的印記狀況。(1)ASCL2基因在肌肉、脂肪、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、子宮、卵巢和垂體中均逃脫印記；(2)NNAT基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在肌肉、脂肪、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、子宮、卵巢和垂體中均為母系印記；(3)DIRAS3基因在肌肉、脂肪、心、肝

6、、脾、肺、腎、胃、小腸、子宮、卵巢和垂體中母系印記；(4)DLX5基因在骨骼肌、脂肪、肺、脾、胃和小腸中表達(dá)母本來源的等位基因，即表現(xiàn)為父系印記：而在心、肝、腎、子宮、卵巢、睪丸和垂體中表達(dá)雙親來源的等位基因，即逃脫印記。 3.利用PCR-RFLP技術(shù)，對2個(gè)候選印記基因中存在的SNP位點(diǎn)在不同豬群中進(jìn)行基因分型，并在大白×梅山F2代群體中進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析.結(jié)果表明：(1)ASCL2基因，C1556G位點(diǎn)多態(tài)性與瘦肉率、肥肉率和

7、瘦肥比率的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，與內(nèi)脂率、股二頭肌pH值和背最長肌pH值的相關(guān)性達(dá)到顯著水平(p<0.05)；(2)DLX5基因，C300T位點(diǎn)多態(tài)性與6-7肋問背膘厚、胸腰椎間膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、肥肉率、胴體長和骨率的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。 4.DIRAS3基因第一外顯子CpG島的父本等位基因各CG位點(diǎn)甲基化水平整體比較低，但各組織間又有其特點(diǎn)：例如肌肉和肝臟中特定位點(diǎn)甲基化，在41個(gè)

8、CG位點(diǎn)中肌肉組織偏向CG19、CG35甲基化，肝臟中偏向CG25、CG34甲基化，其他位點(diǎn)非甲基化；睪丸組織中41個(gè)位點(diǎn)中全是非甲基化；子宮組織中所有克隆子甲基化水平偏向兩個(gè)極端；脾臟和腎臟中隨機(jī)甲基化。而DLX5基因第一外顯子CpG島的所有CG位點(diǎn)都呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)。 5.利用24條隨機(jī)引物和12條半錨定引物配對擴(kuò)增，篩選到9條符合條件的EST(即在一個(gè)親本和一個(gè)子代中表達(dá)，而在另一個(gè)親本和另一個(gè)子代中不表達(dá))，對符合條件的

9、EST利用“表達(dá)的SNP”進(jìn)行印記驗(yàn)證，結(jié)果表明ACTN3基因?yàn)榉怯∮浕颉A3基因的表達(dá)模式分為以下四種：在卵巢中表現(xiàn)為印記，大梅雜合子個(gè)體表達(dá)與其母本一致的G等位基因，梅大雜合子個(gè)體表達(dá)與其母本一致的A等位基因；在肺臟和心臟中表達(dá)雙親來源的等位基因，即逃脫印記；肌肉、脂肪、子宮和睪丸中差異表達(dá)大白的等位基因，大梅雜合子個(gè)體在這些組織中表達(dá)A等位基因，即父本大白的等位基因，而梅大雜合子個(gè)體肌肉、脂肪、子宮和睪丸中也表達(dá)A等位基因，即