豬胚胎期五個(gè)基因的分離、印記鑒定及甲基化分析.pdf

1、印記基因是指來(lái)自雙親的兩個(gè)等位基因的表達(dá)具有傾向性,只表達(dá)一個(gè)親本的,另一個(gè)親本的不表達(dá)或者表達(dá)量很低的一類基因。它們對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎的生長(zhǎng)、發(fā)育、胎盤的功能以及繁殖性狀等方面起著重要作用。印記基因不但調(diào)控一些與質(zhì)量性狀相關(guān)的基因的表達(dá),而且還影響許多數(shù)量性狀的表型方差和表型值。全基因組掃描發(fā)現(xiàn)許多QTLs是父本或者母本印記的,它們與生長(zhǎng)、背膘厚、胴體組成和繁殖性狀相關(guān)。與人和鼠中印記基因的研究相比,在豬中對(duì)印記的研究很少。因此,在豬中鑒

2、定新的印記基因非常重要,這不但可以完善家畜中印記基因的研究,而且可以加強(qiáng)基因組印記在不同物種中的比較基因組學(xué)分析。
　　 本研究利用RT-PCR-RFLP和直接測(cè)序的方法,鑒定了5個(gè)基因在妊娠30天、65天和100天胚胎中的印記狀態(tài)。運(yùn)用RCR-RFLP,檢測(cè)了4個(gè)基因的SNP,以及其在不同品種中的等位基因頻率,并且將這些多態(tài)位點(diǎn)與大白豬和梅山豬交配的F2代群體的胴體性狀和肉質(zhì)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。運(yùn)用熒光定量和半定量RT-PCR

3、的方法分析了目的基因的組織表達(dá)情況。獲得4個(gè)基因的啟動(dòng)子序列,并對(duì)其中2個(gè)基因的啟動(dòng)子活性進(jìn)行分析,且分析了其CpG島的甲基化情況,具體結(jié)果如下:
　　 1.分離克隆了豬DIO3、RTL1、DIRAS3和COPG2基因,都包含完整的開(kāi)放閱讀框(ORF),預(yù)測(cè)的氨基酸序列與人和鼠具有很高的相似性。
　　 2.利用RT-PCR-RFLP和PCR直接測(cè)序的方法,在大白豬與梅山豬正反交產(chǎn)生的30 d、65 d和100 d胚胎中檢

4、測(cè)了DIO3、RTL1、NNAT、DIRAS3和COPG2基因的印記狀態(tài):DIO3、RTL1和DIRAS3基因在30 d胚胎、65 d和100 d胚胎的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、小腸、肌肉、腦和胎盤組織都表現(xiàn)為父本表達(dá)；NNAT基因在65 d和100 d胚胎的脾臟組織中為雙表達(dá),其余組中都是父本表達(dá)；COPG2基因在各個(gè)階段都是雙表達(dá)的。
　　 3.用熒光定量PCR方法檢測(cè)了DIO3基因在二月齡大白母豬不同組織中的表達(dá)情

5、況,在脂肪組織中表達(dá)量最高。用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了RTL1基因在大白豬65d胚胎的13個(gè)組織中的表達(dá)情況,在小腸、股二頭肌和半腱肌中表達(dá)量較高；利用用熒光定量PCR的方法檢測(cè)其在兩個(gè)豬種(梅山豬和大白豬)的4個(gè)發(fā)育階段(胚胎60 d,出生后35,60和120天)的三種類型的肌肉(背最長(zhǎng)肌、股二頭肌和半腱肌)中的表達(dá)情況；并且用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了其隨著C2C12細(xì)胞分化的表達(dá)量降低。檢測(cè)到豬COPG2基因存在五個(gè)不同

6、的轉(zhuǎn)錄本,分別命名為COPG2—1、COPG2-2、COPG2-3、COPG2-4和COPG2-5,利用半定量RT-PCR的方法分析了不同轉(zhuǎn)錄本在豬胚胎期65 d和出生后二月齡各10個(gè)組織中的表達(dá)情況。
　　 4.利用數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列,設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增獲得了豬RTL1、NNAT和DIRAS3基因的啟動(dòng)子序列,利用基因組步移的方法獲得了豬LCAT基因的啟動(dòng)子序列。發(fā)現(xiàn)RTL1和NNAT基因啟動(dòng)子區(qū)存在許多與肌肉發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

7、結(jié)合位點(diǎn),如MyoD、YY1及NF-kappaB等,并且雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)了RTL1和NNAT基因的啟動(dòng)子活性。對(duì)RTL1和NNAT基因的啟動(dòng)子區(qū)的CpG島進(jìn)行了預(yù)測(cè),并且用亞硫酸氫鹽測(cè)序法對(duì)其甲基化狀態(tài)進(jìn)行了分析,初步推測(cè)NNAT基因的啟動(dòng)子區(qū)的兩個(gè)CpG島可能是差異甲基化區(qū)。
　　 5.利用PCR-RFLP技術(shù),對(duì)DIO3、RTL1、NNAT和COPG2基因中的SNP位點(diǎn)在不同品種豬中進(jìn)行了基因分型,并在大白豬和梅山

8、雜交產(chǎn)生的F2代群體中進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明(1)DIO3基因外顯子A687C位點(diǎn)與瘦肥肉比率、肥肉率、瘦肉率、板油重、肩部膘厚、6-7腰椎間膘厚、臀部膘厚、眼肌面積、背最長(zhǎng)肌含水量、背最長(zhǎng)肌失水率、背最長(zhǎng)肌系水力、背最長(zhǎng)肌肌肉色值、股二頭肌肌肉色值、背最長(zhǎng)肌大理石紋、股二頭肌大理石紋呈顯著相關(guān)(P<0.05),與肌內(nèi)脂肪含量呈極顯著相關(guān)(P<0.01)；(2)RTL1基因外顯子G1209A位點(diǎn)與皮率、內(nèi)脂率、6-7腰椎間膘厚、胸

9、腰椎間膘厚、背最長(zhǎng)肌pH、股二頭肌肌肉色值呈顯著相關(guān)(P<0.05),與骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最長(zhǎng)肌失水率、背最長(zhǎng)肌系水力、背最長(zhǎng)肌肌肉色值呈極顯著相關(guān)(P<0.01)；RTL1基因外顯子A3929G位點(diǎn)與內(nèi)脂率、肩部膘厚、眼肌高、眼肌面積、背最長(zhǎng)肌含水量、背最長(zhǎng)肌肌肉色值、背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪量顯著相關(guān)(P<0.05),與皮率、背最長(zhǎng)肌失水率、背最長(zhǎng)肌系水力、股二頭肌肌肉色值呈極顯著相關(guān)(P<0.01)；(3)NNAT基