大白豬和二花臉豬妊娠后期胎盤(pán)轉(zhuǎn)錄譜比較及印記基因鑒定研究.pdf

1、中國(guó)豬高產(chǎn)仔優(yōu)良種質(zhì)特性的遺傳機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外有關(guān)研究人員關(guān)心的熱點(diǎn)。研究表明,在胚胎著床以前中國(guó)梅山豬與大白豬的子宮中胚胎數(shù)目沒(méi)有差異,但懷孕結(jié)束后的產(chǎn)仔數(shù)卻存在顯著差異。已經(jīng)證明這種現(xiàn)象與不同豬種妊娠后期胎盤(pán)效率(胎兒與胎盤(pán)的重量比)有著一定的關(guān)系。在梅山豬的妊娠后期,胎盤(pán)血管密度增加,重量不再有明顯的變化,而大白豬的胎盤(pán)則仍然有一次大幅度的增殖,兩者在胎盤(pán)效率上出現(xiàn)明顯的不同。因此,研究胎盤(pán)效率相關(guān)候選基因可揭示豬的高產(chǎn)機(jī)制并為育

2、種工作提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。
　　 印記基因是指父本或母本的等位基因表達(dá)而另一等位基因不表達(dá)或很少表達(dá)的一類基因。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明,印記基因在胎兒、胎盤(pán)的生長(zhǎng)發(fā)育、母性行為及胎兒出生后的生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。另外,胎盤(pán)的進(jìn)化和基因組印記是同時(shí)出現(xiàn)的,且大部分的印記基因在胎盤(pán)組織高表達(dá)且印記。目前,對(duì)基因組印記的研究主要集中在人和小鼠中,對(duì)家畜特別是豬中的研究很少。因此,在豬胎盤(pán)組織中鑒定印記基因?qū)τ谘芯炕蚪M印記在物

3、種間的保守性和印記基因的功能具有重要意義。
　　 本研究以12頭彼此無(wú)相關(guān)的純種大白豬和二花臉豬(太湖豬的一個(gè)類群)后備母豬為材料,在妊娠75天和90天屠宰后收集胎兒胎盤(pán)樣品(每品種每階段3個(gè)生物學(xué)重復(fù))。每頭母豬后代中隨機(jī)挑選2個(gè)雌性胎兒的胎盤(pán),在提取RNA后等量混合與豬Affymetrix芯片雜交,數(shù)據(jù)校正后應(yīng)用GLM(SAS)模型進(jìn)行了差異表達(dá)基因篩選,并進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了基因本體(GO)功能注釋、聚類及生物學(xué)通路

4、分析。利用采集的胎盤(pán)組織,通過(guò)RT-PCR-RFLP分析和PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)候選印記基因的SNP表達(dá)情況,鑒定了11個(gè)候選印記基因在豬胎盤(pán)組織中的印記狀態(tài)。主要結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)結(jié)合Affymetdx芯片雜交與生物信息及DNA序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)芯片上20201個(gè)轉(zhuǎn)錄本中11849個(gè)轉(zhuǎn)錄本在胎盤(pán)組織中表達(dá):統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)226個(gè)轉(zhuǎn)錄本在二花臉豬和大白豬妊娠75天胎盤(pán)差異表達(dá),577個(gè)轉(zhuǎn)錄本在二花臉豬和大白豬妊娠90天胎盤(pán)差異

5、表達(dá)。
　　 2.GO(Gene Ontology)分析顯示上述差異表達(dá)基因主要是參與能量代謝,胎兒胎盤(pán)發(fā)育,血管發(fā)育和免疫相關(guān)等生物學(xué)過(guò)程。聚類分析發(fā)現(xiàn)二花臉豬妊娠75天和90天,大白豬妊娠75天和90天分別有著更相近的基因表達(dá)模式。
　　 3.從芯片檢測(cè)到的不同品種胎盤(pán)差異表達(dá)基因中選出8個(gè)基因(ALDH1A1、DIO3、DIRAS3、PLAGL1、PON2、ASCL2、WIF1和SLC38A4)進(jìn)行Real-tim

6、e PCR驗(yàn)證,其中5個(gè)為候選印記基因(DIRAS3,PON2,PLAGL1,DIO和ASCL2)。結(jié)果顯示這些基因表達(dá)趨勢(shì)和芯片結(jié)果相吻合。
　　 4.利用Real-time PCR方法,研究了VEGF通路主要基因(VEGF,VEGFR-1,VEGFR-2,VE-cadherin和β-arrestin2)在二花臉豬和大白豬妊娠75天和90天胎盤(pán)的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)基因在品種或時(shí)期間存在差異表達(dá)。
　　 5.根據(jù)人和

7、小鼠印記基因的印記狀況及生理功能,結(jié)合本研究芯片檢測(cè)到的表達(dá)情況,篩選了PEG1、PEG3、PEG5、PEG10、GATM、INPP5F、PON2、DCN、PLAGL1、SLC38A4、DIRAS3和ASCL2等12個(gè)基因作為豬候選印記基因。利用電子克隆和比較基因組學(xué)方法獲得了2個(gè)候選印記基因(PEG1和GATM)的cDNA序列,均包括完整的開(kāi)放閱讀框。
　　 6.通過(guò)RT-PCR-RFLP分析和直接測(cè)序法,鑒定了11個(gè)候選印記

8、基因在豬胎盤(pán)組織中的印記情況。其中,7個(gè)基因(PEG1、PEG3、PEG5、PEG10、PLAGL1、SLC38A4和DIRAS3)在胎盤(pán)組織中為印記表達(dá)基因,4個(gè)基因(PON2、DCN、INPP5F和GATM)在胎盤(pán)組織中為雙等位基因表達(dá)基因(非印記基因)。
　　 7.利用輻射雜種板對(duì)PEG1、PEG3、PEG10、GATM和INPP5F等5個(gè)基因進(jìn)行了染色體精細(xì)定位,分別將其定位在SSC18q13-21、6q22-q23、9

9、p13-21、q12-21和14q29區(qū)域。
　　 8.利用PCR—RFLP技術(shù),對(duì)PEG1、PEG3、PEG10、GATM和1NPP5F基因中的SNP位點(diǎn)在9個(gè)品種中進(jìn)行了基因分型,并對(duì)INPP5F基因HincⅡ多態(tài)位點(diǎn)在大白豬群中進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明該位點(diǎn)多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀30-100kg平均日增重和出生至100Kg平均日增重相關(guān)。
　　 9.發(fā)現(xiàn)PEG5基因在二花臉和大白豬妊娠75天和90天胎盤(pán)組織存在差異表