RNA干擾NPM基因表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、白血病是造血干細(xì)胞克隆性疾病，是一組高度異質(zhì)性的惡性血液病。靶向白血病細(xì)胞的化療是當(dāng)前治療的主要手段，但仍無(wú)法解決白血病的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等諸多問(wèn)題。目前分子水平的靶向治療成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。核仁磷酸蛋白(NPM)是主要位于核仁顆粒區(qū)的一種多功能蛋白。NPM直接參與核糖體的合成、中心體的復(fù)制等細(xì)胞增殖過(guò)程中的關(guān)鍵分子事件；同時(shí)NPM通過(guò)干擾素調(diào)節(jié)因子發(fā)揮凋亡調(diào)節(jié)作用。NPM基因異常可導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖和抵抗凋亡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。已知

2、多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞高表達(dá)NPM，NPM可作為診斷肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的分子標(biāo)志物。有文獻(xiàn)報(bào)道白血病細(xì)胞中不同程度地高表達(dá)NPM，但NPM參與白血病發(fā)生的分子機(jī)制尚未闡明。RNA干擾技術(shù)是一種新的基因治療技術(shù)，能有效、特異地抑制細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，利用RNAi抑制某些功能基因或融合基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，已成為白血病基因治療的一條新途徑。 本研究采用RNA干擾技術(shù)，以NPM高表達(dá)的白血

3、病K562細(xì)胞系為研究對(duì)象，分析抑制NPM表達(dá)對(duì)白血病細(xì)胞增殖和凋亡的影響。主要結(jié)果和結(jié)論如下： 1.檢測(cè)白血病細(xì)胞NPM mRNA和蛋白表達(dá)。采用RT-PCR、FQ-PCR.以及免疫組化檢測(cè)K562細(xì)胞NPM基因和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞高表達(dá)NPM mRNA，模板拷貝數(shù)較正常血細(xì)胞高7.3倍，同時(shí)白血病細(xì)胞高表達(dá)NPM蛋白，提示白血病細(xì)胞高表達(dá)NPM基因。 2.構(gòu)建靶向NPM基因的RNAi重組體，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后

4、觀察shRNA對(duì)靶基因的抑制作用。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建靶向NPM基因的pGenesil-1/NPM重組體，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將重組體導(dǎo)入K562細(xì)胞后，F(xiàn)Q-PCR.檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞NPM mRNA拷貝數(shù)下降70％，免疫組化結(jié)果揭示轉(zhuǎn)染細(xì)胞NPM蛋白水平的明顯下調(diào)，證明pGenesil-1/NPM能夠高效沉默K562細(xì)胞NPM基因的表達(dá)。 3.觀察抑制NPM基因?qū)562細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。運(yùn)用MTT、半固體培養(yǎng)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)R