WT1基因表達對白血病細胞生物學特征的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、研究目的：在不表達WT1基因的U937細胞中轉(zhuǎn)導WT1基因，觀察U937細胞增殖、凋亡、周期、對藥物的反應性及細胞遷移能力等生物學特性的改變，進一步探究WT1基因在白血病中的作用及相關(guān)機制。
　　 研究方法：采用PCR方法從質(zhì)粒載體pCMV-CB6-WT1-B(+17aa/-KTS)、pCMV-CB6-WT1-D（+17aa/+KTS）擴增目的片段WT1-B(+17aa/-KTS)和WT1-D(+17aa/+KTS)，連接到pC

2、DHI-MCS1-EF1-copGFP慢病毒載體上，采用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝病毒，感染U937細胞，流式分選GFP陽性細胞，篩選出穩(wěn)定表達WT1基因的單克隆細胞，RT-PCR及western blot方法鑒定WT1基因及蛋白的表達，隨后檢測轉(zhuǎn)導WT1基因后U937細胞生物學特性的改變。采用MTT方法檢測細胞的增殖活性和姜黃素對單克隆細胞的抑制率。采用流式細胞技術(shù)檢測單克隆細胞加入姜黃素后細胞周期和凋亡的改變。采用甲基纖維

3、素半固體培養(yǎng)基觀察各單克隆細胞集落形成能力的差別。應用Transwell遷移實驗觀察各單克隆細胞遷移能力的差別。同時采用基因表達譜芯片檢測分析WT1表達引起功能相關(guān)的基因改變和涉及的信號通路，并用定量RT-PCR驗證基因表達的可信性。
　　 結(jié)果：WT1(-KTS)和WT1(+KTS)沒有明顯改變U937細胞的增殖活性(p＞0.05)，但降低了對姜黃素的敏感性、能對抗姜黃素引起的U937細胞凋亡（p均＜0.05）。WT1(-KT

4、S)還提高了U937細胞的集落形成能力(p＜0.01)和遷移能力(p＜0.01)，而WT1(+KTS)則未明顯改變U937細胞的集落形成能力和遷移能力（p均＞0.05）。雖然WT1(-KTS)和WT1(+KTS)沒有明顯改變細胞周期，但加姜黃素處理后，空載體與轉(zhuǎn)導WT1細胞的周期改變有顯著性差異(p＜0.05)。基因芯片分析結(jié)果顯示，WT1(-KTS)引起的顯著性差異基因涉及細胞增殖、凋亡、粘附遷移、細胞周期調(diào)節(jié)等功能，差異基因參與的信

5、號轉(zhuǎn)導通路主要有JAK-STAT途徑、趨化因子信號途徑、MAPK信號途徑、mTOR信號途徑、ErbB信號途徑等。而WT1(+KTS)引起的顯著性差異基因則明顯少于WT1(-KTS)，主要涉及細胞生長、凋亡、代謝過程等。
　　 結(jié)論：不同的WT1異構(gòu)體在白血病發(fā)生中的作用不全相同。WT1(-KTS)抑制U937細胞凋亡，降低U937細胞對化療藥物的敏感性，促進細胞遷移及集落形成，可能與激活JAK-STAT途徑、趨化因子信號途徑、M