WT1基因表達(dá)改變對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)特征的影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:觀察WT1基因及蛋白在白血病細(xì)胞中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況,研究WT1蛋白抑制劑一姜黃素,對(duì)白血病細(xì)胞(尤其是慢粒急變細(xì)胞系-K562)增殖能力的影響,并探討相關(guān)機(jī)制。采用RNA干擾技術(shù),以WT1特異性shRNA下調(diào)WT1的表達(dá),觀察細(xì)胞的增殖能力、自我更新能力、細(xì)胞周期、凋亡及分化等生物學(xué)效應(yīng),進(jìn)一步探究WT1與白血病細(xì)胞生物學(xué)特征改變相關(guān)的機(jī)制。
　　 研究方法:采用Real time-PCR和Western blo

2、t方法觀察WT1 mRNA及蛋白在不同白血病細(xì)胞系中的表達(dá)及亞細(xì)胞定位,同時(shí)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察WT1的亞細(xì)胞定位。Chromatin ImmunoPrecipitation-DNA Selection and Ligation(CHIP-DSL)方法用于尋找WT1可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶基因。MTT方法觀察細(xì)胞的增殖并繪制增殖曲線、觀察姜黃素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及與格列衛(wèi)、依托泊甙(VP-16)的協(xié)同作用,計(jì)算增殖抑制率。采用流式細(xì)胞技術(shù)

3、檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡及分化等相關(guān)指標(biāo)。設(shè)計(jì)WT1特異的短發(fā)夾RNA(即WT1-shRNA)片段,構(gòu)建pLKO.1-puro載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝慢病毒,感染K562細(xì)胞,進(jìn)而檢測(cè)WT1基因下調(diào)后細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的改變,同時(shí)分析WT1可能的靶基因-Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的變化。
　　 結(jié)果:WT1基因在多種白血病細(xì)胞系中表達(dá)(U937細(xì)胞除外),尤其以K562細(xì)胞高表達(dá)；Western blot及細(xì)胞免疫熒光

4、均提示W(wǎng)T1蛋白在細(xì)胞核及胞漿中均有分布,以胞漿中為主。
　　 因K562細(xì)胞高表達(dá)WT1,且為慢粒急變細(xì)胞系,對(duì)多種常規(guī)化療藥物不敏感,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究集中在K562細(xì)胞進(jìn)行:
　　 1、采用WT1蛋白抑制劑一姜黃素處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其明顯抑制細(xì)胞的增殖,呈劑量、時(shí)間依賴性,其IC50值在24、48及72小時(shí)分別為28.15μM、33.79μM及38.12μM。姜黃素聯(lián)合慢粒治療的靶向藥物-酪氨酸激酶抑制劑-格列衛(wèi),二者具有

5、協(xié)同抗白血病細(xì)胞增殖的作用。檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原發(fā)現(xiàn),姜黃素處理后CD13表達(dá)明顯增加,CD11b稍有增加,提示姜黃素有促使細(xì)胞向成熟階段分化的潛能；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),姜黃素使G2/M期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增高(7.11±2.46 vs28.50±3.49),而G0/G1期及S期細(xì)胞比例減低。
　　 2、設(shè)計(jì)針對(duì)WT1基因的特異shRNA,下調(diào)K562細(xì)胞中WT1基因的內(nèi)源表達(dá),發(fā)現(xiàn):WT1-shRNA干擾組細(xì)胞增殖能力減弱、集

6、落形成能力明顯減低,但無(wú)明顯細(xì)胞凋亡及分化趨勢(shì)；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),干擾組G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加,而S期比例減低；聯(lián)合藥物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),WT1-shRNA干擾組細(xì)胞對(duì)VP-16更敏感,其增殖抑制作用強(qiáng)于對(duì)照組。
　　 3、進(jìn)一步探討WT1在白血病發(fā)生中的相關(guān)作用機(jī)制,ChIP-DSL啟動(dòng)子芯片分析結(jié)果顯示,WT1參與多種信號(hào)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,其中主要包括Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的多個(gè)基因；MAPK信號(hào)通路相關(guān)基

7、因；凋亡及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因等。結(jié)合ChIP-DSL結(jié)果,重點(diǎn)研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的相關(guān)基因,實(shí)驗(yàn)觀察到:(1)姜黃素處理細(xì)胞24及48小時(shí)后,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Wnt非經(jīng)典途徑重要基因-SUZ12 mRNA下調(diào)50-60％,其蛋白水平表達(dá)也下調(diào)達(dá)30％左右,而Wnt途徑其它相關(guān)基因,如 Wnt3a、Wnt5a、Wnt11及β-catenin在mRNA及蛋白水平均上調(diào)(有的達(dá)2倍以上)。(2)WT1-shRNA

8、特異性下調(diào)WT1基因后,經(jīng)典及非經(jīng)典途徑的多數(shù)基因如β-catenin、SUZ12、Wnt11在mRNA及蛋白水平均明顯下調(diào),而Wnt3a、Wnt5a稍有升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn),β-catenin的亞細(xì)胞定位亦發(fā)生改變,其直接靶基因CCND1及MYC的表達(dá)也明顯下調(diào),這可能是WT1干擾后細(xì)胞周期出現(xiàn)G0/G1期阻滯的原因。
　　 結(jié)論:
　　 1.WT1基因在多種白血病細(xì)胞系高表達(dá)。
　　 2.WT1蛋白抑制劑-姜黃素能

9、明顯抑制白血病細(xì)胞的增殖及集落形成能力,具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞向較成熟階段分化的潛能,使細(xì)胞阻滯于G2/M期。
　　 姜黃素聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑-格列衛(wèi)有協(xié)同抗增殖作用,二者均可明顯降低BCR/ABL p210融合基因的拷貝數(shù),以上在慢性粒細(xì)胞白血病的臨床診治工作中將具有重要意義。
　　 3.采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)WT1后,K562細(xì)胞的增殖及集落形成能力明顯下降,對(duì)化療藥物的敏感性增加。
　　 4.WT1基因是白