WT1基因異構(gòu)體對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、目的:優(yōu)化懸浮培養(yǎng)的白血病細(xì)胞電穿孔轉(zhuǎn)染的條件.將攜帶WT1基因四種異構(gòu)體全長cDNA的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)白血病細(xì)胞株NB<,4>,建立穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株.探討WT1基因及其異色體對(duì)急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株NB<,4>增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制.方法:通過調(diào)整電壓、電容、細(xì)胞狀態(tài)、溫度及緩沖液等不同轉(zhuǎn)染條件,以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因,用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,優(yōu)化懸浮培養(yǎng)白血病細(xì)胞的電穿孔

2、轉(zhuǎn)染條件.用電穿孔的方法分別將對(duì)照質(zhì)粒pCB6+及攜帶WT1基因四種主要異構(gòu)體WTA(-17aa/-KTS)、WTB(+17aa/-KTS)、WTC(-17aa/+KTS)、WTD(+17aa/+KTS)全長cDNA的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)白血病細(xì)胞株NB<,4>,建立穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株并用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化.采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法、MTT比色法、甲基纖維素集落形成試驗(yàn)及細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)檢測(cè), 了解表達(dá)外源性WT1基因異構(gòu)體WTA從而將WT

3、1基因異構(gòu)體表達(dá)的比例由+17AA/+KTS優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?17AA/-KTS優(yōu)勢(shì)型對(duì)NB<,4>細(xì)胞生長的影響.通過形態(tài)學(xué)觀察,NBT還原試驗(yàn),細(xì)胞表面分化抗原CD11b的檢測(cè)了解外源性表達(dá)WT1基因異構(gòu)體WTA對(duì)NB<,4>細(xì)胞分化的影響.用DNA凝膠電泳,流式細(xì)胞儀測(cè)定AnnexinV結(jié)合力等方法觀察WT1基因異構(gòu)體表達(dá)比例的轉(zhuǎn)變對(duì)白血病細(xì)胞NB<,4>誘導(dǎo)凋亡的作用.用RT-PCR方法檢測(cè)WT1基因異構(gòu)體WTA轉(zhuǎn)導(dǎo)NB<,4>細(xì)胞

4、后,NB<,4>細(xì)胞PML/RARα、RbAP46、P21、P53、Bcl-2、Bcl-XL、VEGF和C-myc等相關(guān)基因表達(dá)的改變.運(yùn)用cDNA微陣列技術(shù)檢測(cè)WT1基因異構(gòu)體表達(dá)比例的轉(zhuǎn)變對(duì)NB<,4>細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響.并用RT-PCR方法驗(yàn)證CyclinA1及CDK7基因表達(dá)的改變.結(jié)論:①WT1基因異構(gòu)體能夠通過電穿孔的方法成功轉(zhuǎn)染懸浮培養(yǎng)的白血病細(xì)胞NB<,4>,并建立單克隆化的永久表達(dá)細(xì)胞株.②增加外源性WT1基因異構(gòu)體

5、WTA的表達(dá)從而將WT1基因異構(gòu)體表達(dá)的比例由+17AA/+KTS優(yōu)勢(shì)型轉(zhuǎn)變?yōu)?17AA/-KTS優(yōu)勢(shì)型能抑制白血病細(xì)胞株NB<,4>的增殖,使其克隆形成能力明顯下降.同時(shí)也能部分抑制ATRA對(duì)NB<,4>細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用,使NB<,4>細(xì)胞對(duì)As<,2>O<,3>引起的凋亡更為敏感.這些改變可能與PML/PARα、P21、C-myc等基因的表達(dá)上調(diào),Bcl-2基因的表達(dá)下調(diào)有關(guān).③WT1基因異構(gòu)體WTA表達(dá)比例增加能引起NB<,4>