遺傳性耳聾基因診斷新技術的研究和應用與非綜合征性耳聾家系的分子遺傳學研究.pdf

1、全國性聾病分子流行病學研究數(shù)據(jù)顯示，盡管遺傳性耳聾具有廣泛的遺傳異質性，但大多數(shù)非綜合征性遺傳性耳聾僅由為數(shù)不多的幾個基因突變所致，如GJB2基因、線粒體DNA基因、SLC26A4基因等，從而奠定了在中國開展耳聾基因診斷的理論基礎，同時也催生出新的耳聾整體預防思路和方法。本課題致力于通過設計經(jīng)濟、高效、快速、高通量適合中國國情的耳聾基因診斷方法，為建立標準化、規(guī)范化的耳聾基因診斷、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷模式提供技術支持，使耳聾基因組研究所取

2、得的偉大成果能夠被廣泛應用于中國臨床遺傳性耳聾病因學診斷和聾兒出生缺陷防控的實踐，實現(xiàn)其“基礎-臨床”的順利轉化，從而推動國內臨床耳聾基因診斷、遺傳咨詢和基于耳聾基因診斷的產(chǎn)前診斷工作的廣泛開展，最終實現(xiàn)總體降低耳聾發(fā)生及出生缺陷的目標。本課題另外一個重要內容就是收集到湖南地區(qū)一個表現(xiàn)為X-連鎖或母系遺傳方式的遺傳性耳聾大家系，通過對這一家系的臨床特征及分子病因學研究，進一步探討mtDNA突變同非綜合征耳聾之間的關系，并為進行耳聾致病基

3、因的功能研究打下了基礎。本研究包括以下三個部分。
　　 第一部分運用PE-DHPLC技術快速檢測中國人群非綜合征型耳聾熱點基因突變
　　 目的：建立針對中國人幾種常見的遺傳性耳聾基因型的基因診斷新方法。
　　 方法：PCR擴增的靶序列，經(jīng)引物延伸，得到中國人非綜合征性耳聾6個常見突變的特異性延伸片段(GJB2-235delC、GJB2-299delAT、PDS IVS7-2A>G、PDS A2168G、mtDNA

4、A1555G、mtDNA C1494T)，用全變性高效液相色譜分析延伸片段混合物，分離圖譜可鑒定被檢樣本的基因型。
　　 結果：所選擇的120例散發(fā)非綜合征性耳聾樣品的引物延伸變性高效液相色譜與經(jīng)測序驗證在結果吻合，前來遺傳咨詢的4個小家系的引物延伸變性高效液相色譜與測序結果亦相吻合，該法的準確率達100％。
　　 結論：該法是一種準確、高效的檢測非綜合征性耳聾基因突變的分析方法，可用于非綜合征性耳聾基因及其他遺傳疾病的

5、診斷及遺傳咨詢。
　　 第二部分基因芯片技術在散發(fā)非綜合征性耳聾基因診斷中的應用
　　 第一章基因芯片技術應用于耳聾基因檢測的可行性研究
　　 目的：分析基因芯片技術應用于非綜合征性耳聾基因檢測的準確性，為建立新的基因檢測方法提供依據(jù)。
　　 方法：通過對122例散發(fā)的非綜合征性耳聾患者進行芯片及測序的雙盲檢測實驗，驗證GJB2_235delC在這些散發(fā)樣本中的分布情況.
　　 結果：隨機選取的1

6、22例樣本的GJB2235delC的芯片檢測與測序結果基本吻合，該法的準確率達89.9％。
　　 結論：該款芯片具有快速、高通量、高準確性、等特點，適合于大樣本量遺傳性耳聾的基因檢測。
　　 第二章基因芯片檢測技術在散發(fā)非綜合征性耳聾患者中的應用
　　 目的：應用Goldengate耳聾基因芯片檢測散發(fā)非綜合征性耳聾患者，研究散發(fā)非綜合征性耳聾的熱點突變基因及耳聾基因位點的關聯(lián)分析，為建立新的基因檢測方法提供依據(jù)

7、及模型。
　　 方法：對389例散發(fā)DNA樣本(其中正常人DNA樣本102例，散發(fā)非綜合征性耳聾患者的DNA樣本287例)進行芯片檢測，應用關聯(lián)分析研究耳聾及所選位點的相關性.
　　 結果：6個位點WFS1_Leu829Pro、GJB3_Arg32Trp、OTOF_IVS5+1、TMIE_IVS2_2、PCDH15_3_BP_DEL_5601_5603aac及SLC26A4_Gly497Ser與耳聾的關聯(lián)分析為負相關；r

8、s4809261、rs7421943、MYH14_Arg726Ser、TMPRSS3_PRO404LEU、rs878042、COCH_MET512THR、MY03A_IVS7_2、TMC1_Tyr259Cys、GJB2_Arg165Trp、rs10515535、rs568619、rs7600176、rs3664、WHRN_IVS2+1、rs4679155及COL9A3_9_BP_DEL_541_549ggtccccca與耳聾的關聯(lián)分析為

9、正相關。
　　 結論：基因芯片技術的建立及成功運用是對聾病基因檢測手段的創(chuàng)新和突破，同時表明NSHL具有高度的遺傳異質性。
　　 第三部分線粒體12SrRNA1555A>G突變在一個中國耳聾大家系的特殊表現(xiàn)及分析
　　 目的：線粒體突變是導致耳聾的重要原因，本文旨在探討線粒體基因組1555A>G突變在一個中國耳聾大家系的特殊表現(xiàn)及分析。
　　 方法收集一遺傳性耳聾大家系5代48人，提取樣品DNA后，首先采

10、用X-linkage連鎖分析，未發(fā)現(xiàn)變異，再采用DNA直接測序法對家系成員進行線粒體全基因組、GJB2編碼區(qū)及POU3F4基因進行序列分析。
　　 結果：經(jīng)過計算，連鎖分析所有位點LOD值結果均小于1，不支持連鎖；經(jīng)mtDNA基因組序列分析發(fā)現(xiàn)12 SrRNA基因A1555G突變是此家系的唯一致病突變，同時患者均攜帶一新的變異14163C>T。
　　 結論：線粒體A1555G兔變是本家系耳聾的主要原因，環(huán)境因素及氨基甙類