Bartter綜合征遺傳學(xué)分析與耳聾基因芯片研發(fā).pdf

1、第一部分Ⅳ型Bartter綜合征遺傳學(xué)分析
　　背景:Bartter綜合征(Bartter syndrome，BS)是一組臨床表現(xiàn)為腎性失鹽、低鉀血癥、代謝性堿中毒、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增強的遺傳性疾病，主要為常染色體隱性遺傳。根據(jù)不同的臨床特點，可將BS分為3型:經(jīng)典型BS（包括Gitelman綜合征）、新生兒型BS、新生兒型BS伴感音神經(jīng)性耳聾。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)6個與BS有關(guān)的常染色體基因:NKCC2、 ROMK、

2、CLCNKB、BSND、CLCNKA、NCCT。根據(jù)遺傳學(xué)的特征，可將BS分為6型:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型，其中Ⅳ型、Ⅴ型為新生兒型伴感音神經(jīng)性耳聾，Ⅵ型為Gitelman綜合征。
　　目的:本研究小組收集了一個Bartter綜合征的散發(fā)病例，患者同時伴有感音神經(jīng)性耳聾，擬通過分析臨床特征與基因突變檢測尋找病因。
　　方法:對患者及父母進行了病史采集、體格檢查及輔助檢查，并選取100名正常人群作為對照組，進行了G

3、JB2、BSND、CLCNKA、CLCNKB等四個基因的外顯子篩查。
　　結(jié)果:患兒的臨床表現(xiàn)為:新生兒期發(fā)病，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性增高，低鉀血癥、低氯血癥，生長發(fā)育遲緩，神經(jīng)性耳聾，腎臟影像學(xué)無明顯異常，具有羊水過多和早產(chǎn)史，符合Ⅳ型Bartter綜合征的典型癥狀。同時，患兒的BSND基因第一個外顯子存在純和突變c.22C＞T和c.127G＞A，GJB2基因存在復(fù)合雜合突變即c.235delC和c.109G＞A。而患

4、兒父母BSND基因均存在雜合突變c.22C＞T和c.127G＞A，父親GJB2基因存在雜合突變c.109G＞A，母親GJB2基因存在雜合突變c.235delC。患兒及父母均未發(fā)現(xiàn)CLCNKA和CLCNKB基因的變異。正常對照組中37例存在BSND c.127位雜合等位基因G/A，2例存在BSND基因c.127位純和等位基因A/A。
　　結(jié)論:1.本研究所報道的Ⅳ型Bartter綜合征患者同時攜帶BSND與GJB2基因變異屬世界首次

5、報道;2.患兒Ⅳ型BS是由BSND基因純和突變c.22C＞T導(dǎo)致，而患兒GJB2基因的復(fù)合雜合突變可能在耳聾發(fā)生過程中有一定的作用;3.患兒攜帶的BSND基因變異c.127G＞A為單核苷酸多態(tài)性。
　　第二部分Goldengate耳聾基因芯片的優(yōu)化設(shè)計
　　背景:耳聾是最常見的感覺神經(jīng)性疾病，它不僅是造成聽力殘疾、影響人類身心健康的疾病，而且給患者的生活、家庭、工作和學(xué)習(xí)中的交流帶來極大的不便。與此同時，耳聾也給社會帶來了沉

6、重的負擔。據(jù)報道，全球有2.5億人患有中度以上聽力損失。耳聾遺傳學(xué)研究表明，人類23對染色體中的22對都分布有耳聾遺傳位點，線粒體基因也與耳聾相關(guān)。約有半數(shù)的先天性耳聾與遺傳因素有一定聯(lián)系。隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，逐漸衍生出一些基因診斷手段，然而這些方法無法同時具備高通量、覆蓋面廣、低成本、高準確性的特征，因此對遺傳性耳聾的基因診斷需要進行革命性的改革。在本課題組的前期工作中，設(shè)計了具有384個位點的Goldengate耳聾基因芯片。其中包括

7、240個耳聾相關(guān)突變位點（77個顯性突變位點及163個隱性突變位點）和144個SNP位點。應(yīng)用該耳聾基因芯片對465個DNA模板進行篩查，統(tǒng)計分析了芯片Call rate、SNP位點的等位基因頻率。結(jié)果顯示，芯片總Call rate為96.32％; GJB2235delc檢測位點的假陽性率為3.1％，假陰性率為0;對一個非綜合征型顯性遺傳耳聾家系進行SNP位點的連鎖分析，其結(jié)果與傳統(tǒng)的微衛(wèi)星定位掃描方法的定位結(jié)果相似，認為該芯片具備初步

8、進行耳聾相關(guān)基因的排除定位連鎖分析的能力。然而，芯片結(jié)果存在目前不能解釋的疑點:第一，初步應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)部分不常見突變位點在檢測過程中出現(xiàn)較高的陽性檢測率，如PJVK_988delG為57.36％、SLC26A4_Gly497Ser為7.14％;第二，部分位點的call rate較低;第三，部分患者為多種基因突變位點的攜帶者或純合子基因型;第四，部分正常人群的檢測結(jié)果存在一種或多種突變，但并未有耳聾的表現(xiàn)?；谝陨显?，為了獲取具有更高

9、準確性、更具合理性的芯片，本課題小組擬將芯片進行進一步驗證，并根據(jù)驗證結(jié)果優(yōu)化芯片中的耳聾突變檢測位點及SNP位點。
　　目的:驗證第一版Goldengate耳聾基因芯片的準確性。在符合臨床特點及應(yīng)用的基礎(chǔ)上，根據(jù)第一版芯片的經(jīng)驗優(yōu)化Goldengate耳聾基因芯片，使其符合中國耳聾人群遺傳學(xué)特點，具有應(yīng)用性與合理性。
　　方法:第一版Goldengate耳聾基因芯片共有384個位點，隨機挑選芯片中19個突變檢測位點，應(yīng)用S

10、anger測序法驗證其敏感性和特異性。結(jié)合驗證結(jié)果優(yōu)化第一版芯片位點。通過文獻檢索法統(tǒng)計目前國內(nèi)外已報道的所有耳聾相關(guān)突變位點，篩選位點時結(jié)合臨床應(yīng)用，首要原則為:世界范圍內(nèi)突變位點報道次數(shù)大于2次，以中國人群報道次數(shù)較多的位點為主。在滿足第一原則的基礎(chǔ)上，其他輔助原則為:(1)相鄰兩個位點至少間隔60堿基以上;(2)盡量選擇探針評分大于0.6的位點，熱點突變位點探針評分在0.5-0.6之間也可納入芯片;(3)點突變優(yōu)先于長缺失及插入突

11、變;(4)排除第一版芯片中call rate低于70％的位點。SNP位點的替換原則如下:(1) SNP位于亞洲人群中報道的已克隆耳聾相關(guān)基因;(2)與以上選取的耳聾致病突變位點間隔60bp及以上;(3) SNP位點探針評分大于0.6;(4)點突變優(yōu)先于長缺失及插入突變;(5)剔除第一版芯片中call rate分數(shù)低于0.6的SNP位點。將優(yōu)化設(shè)計后的384個位點的探針評分與前期芯片的評分進行t檢驗比較，初步判斷芯片位點選擇的合理性。

12、r>　　結(jié)果:1.第一版Goldengate耳聾基因芯片位點的敏感性從0％-100％不等，特異性均為100％;2.優(yōu)化后的第二版耳聾芯片中包含200個非綜合癥耳聾位點、40個常見綜合征耳聾位點，以及144個SNP位點;3.耳聾突變位點包含中國人群最常見的8個熱點突變，如下: GJB2_1_BP DEL_35delG、 GJB2_1_BP_ DEL_235C、GJB2_2_BP_ DEL_299_300at、 GJB3_Arg180Ter

13、m[C/T]、SLC26A4_Asn392Tyr[A/T] SLC26A4_IVS7_2[A/G]SLC26A4_His723Arg[A/G]、線粒體12rsRNA1555[A/G];4.第二版芯片覆蓋綜合征和非綜合征型耳聾的46個核基因與線粒體基因;5.兩版芯片探針設(shè)計評分進行t檢驗，P＜0.05，統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異;6.第二版芯片位點采用自主性命名，達到實用性強、易解讀、易判斷芯片結(jié)果的作用。
　　結(jié)論:1.第一版芯片的特