原發(fā)和復(fù)發(fā)骨巨細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因的鑒定及其生物信息學(xué)分析.pdf

1、骨巨細(xì)胞瘤（Giant Cell Tumor of Bone，GCTB）是一種相對(duì)少見的腫瘤，雖為良性，但具有極強(qiáng)的侵襲性，主要表現(xiàn)為長骨干骺端的大范圍骨質(zhì)破壞、明顯的復(fù)發(fā)傾向和少數(shù)肺轉(zhuǎn)移。手術(shù)治療是其主要治療手段，手術(shù)方式主要包括病灶刮除術(shù)與瘤段切除術(shù)。據(jù)以往研究報(bào)道，GCTB手術(shù)后局部復(fù)發(fā)率高達(dá)20％～50%，同時(shí)，約有10%GCTB會(huì)發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，1%~4%會(huì)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。因GCTB組織來源尚不明確,生物學(xué)行為復(fù)雜多變，預(yù)后不容易準(zhǔn)

2、確判斷，是當(dāng)今臨床骨科腫瘤性疾病診療中的難題。
　　以往依據(jù)巨細(xì)胞的數(shù)量和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞組織學(xué)特征，對(duì)GCTB進(jìn)行Jaffe病理分級(jí)。但經(jīng)長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，Jaffe病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)與GCTB生物學(xué)行為以及患者的預(yù)后不甚相符。有些Jaffe病理分級(jí)為Ⅰ級(jí)，卻發(fā)生早期肺轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。而基于X線檢查的Campanicci’s分級(jí)，以及將臨床癥狀、X線檢查和病理變化三者結(jié)合在一起的Ennecking分級(jí)，雖然對(duì)GCTB具有一定的參考價(jià)值，但與J

3、affe病理分級(jí)一樣，均不能完全準(zhǔn)確反映其惡性程度、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的傾向。因此，研究開發(fā)新的GCTB分子標(biāo)志物，對(duì)正確評(píng)估GCTB的生物學(xué)行為，促進(jìn)GCTB診治效果有重要臨床意義。
　　近幾年,隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，通過基因芯片技術(shù)探討GCTB發(fā)生分子機(jī)制，并力圖在分子水平上建立GCTB分級(jí)方法逐漸受到重視。以往有關(guān)骨巨細(xì)胞瘤的相關(guān)研究主要集中在研究者感興趣的個(gè)別基因上。由于GCTB的形成是多基因、多因素相互作用的結(jié)果，對(duì)個(gè)別基因的研

4、究并不能夠充分揭示GCTB發(fā)病與復(fù)發(fā)的復(fù)雜機(jī)制。基于此，本課題將篩選大量骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)差異表達(dá)基因，聯(lián)合生物信息學(xué)手段進(jìn)行研究，以期在分子水平深刻揭示GCTB復(fù)發(fā)分子機(jī)制。
　　本文選取12例原發(fā)GCTB和12例復(fù)發(fā)GCTB組織，應(yīng)用Affymetrix公司最新推出的QuantiGene技術(shù)，對(duì)上述GCTB樣本進(jìn)行多基因定量檢測(cè)分析。采用Fold change方法，計(jì)算復(fù)發(fā)組與原發(fā)組樣本基因的表達(dá)差異，結(jié)果總共獲得顯著差異表達(dá)基因

5、32個(gè)，其中上調(diào)20個(gè)，下調(diào)12個(gè)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用iSubpathwayMiner軟件，首先對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)通路富集分析，獲得了6個(gè)完整的信號(hào)通路，包括Focal adhesion和Cell adhesion molecules；隨后，對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)子通路富集分析，獲得了11個(gè)子通路，新增的有Pathway in cancer，p53 signaling pathway，MAPK signaling

6、 pathway等多個(gè)與腫瘤密切相關(guān)的信號(hào)通路。通過對(duì)子通路進(jìn)行分析還發(fā)現(xiàn)，與骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)的差異表達(dá)基因位于細(xì)胞信號(hào)通路局部區(qū)域的關(guān)鍵位置:1）IGF1位于Pathway in cancer的起始區(qū)域；2）MDM2定位于p53 signaling pathway子通路path:04115_1的中央?yún)^(qū)域；3）MYC，JUN和RAC1分布于Wnt信號(hào)通路子通路path:04310_2的終點(diǎn)；4）JUN，NFKB1，STAT1和RAC1

7、位于破骨細(xì)胞分化通路（osteoclast differentiation pathway）。
　　為了探討關(guān)鍵蛋白最大可能的生物學(xué)效應(yīng)，我們構(gòu)建了骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)差異表達(dá)基因的PPI子網(wǎng)絡(luò)，并綜合運(yùn)用GO注解、亞細(xì)胞定位、網(wǎng)絡(luò)模塊等技術(shù)，對(duì)差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)的潛在生物學(xué)功能、蛋白定位層次和功能模塊進(jìn)行分析評(píng)估。結(jié)果顯示：1）該 PPI網(wǎng)絡(luò)含1893節(jié)點(diǎn)，28713邊；2）該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征顯示度的分布服從冪律曲線，R2為

8、0.838，說明該網(wǎng)絡(luò)具有無尺度特點(diǎn)，為真實(shí)復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)；3）網(wǎng)絡(luò)GO富集分析獲得了432個(gè)GO富集注釋，從中發(fā)現(xiàn)了許多以往與骨巨細(xì)胞瘤相關(guān)的通路；4）亞細(xì)胞定位顯示蛋白節(jié)點(diǎn)分布包括了從胞外-膜-細(xì)胞骨架-胞漿-核內(nèi)等廣泛空間，形成數(shù)量巨大的類似pathway的蛋白級(jí)聯(lián)關(guān)系；5）PPI網(wǎng)絡(luò)模塊分析，從中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)緊密聯(lián)系的模塊。
　　通過在50例骨巨細(xì)胞瘤病例的石蠟標(biāo)本中對(duì)四個(gè)重要基因（MDM2、IGF1、STAT1和RAC1）的

9、免疫組化和多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示：1）這四個(gè)標(biāo)志物的免疫組化染色具有相對(duì)一致的趨勢(shì)，即標(biāo)本對(duì)其中一個(gè)標(biāo)志物陽性，對(duì)另外三個(gè)標(biāo)志物大多數(shù)情況下也呈陽性表達(dá)；2）這四個(gè)基因的高表達(dá)與骨巨細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)顯著相關(guān)；3）這四個(gè)基因是骨巨細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素,可以作為 GCTB預(yù)后分子標(biāo)志物，并有希望成為治療靶標(biāo)。
　　綜上所述，本研究利用基因芯片技術(shù)，篩選出32個(gè)GCTB復(fù)發(fā)差異表達(dá)基因；進(jìn)一步采用生物信息學(xué)手段，獲得了與疾