純鈦表面WNT信號(hào)通路調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)純鈦表面WNT信號(hào)通路調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：純鈦表面Wnt信號(hào)通路對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控效應(yīng)研究。采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法，從SD大鼠股骨內(nèi)獲得高純度的BMSCs。純化后的第三代BMSCs接種至純鈦表面上進(jìn)行培養(yǎng)，加入成骨誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)，7天、14天時(shí)分別進(jìn)行成骨分化的檢測(cè)，驗(yàn)證BMSCs具有向成骨分化的能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示我們提取的BMSCs純

2、度較高。茜素紅染色以及ALP、OC的檢測(cè)結(jié)果均表明BMSCs已經(jīng)分化成為成骨細(xì)胞，驗(yàn)證了BMSCs具有向成骨細(xì)胞分化的能力。將BMSCs以1×104/cm2密度接種至純鈦表面，設(shè)立誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組。接種24 h后換含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的DMEM(L)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入成骨誘導(dǎo)液，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)組條件為:DMEM(L)培養(yǎng)液+體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+1*10-7mol/L地塞米松+50m

3、g/L抗壞血酸C。7天后用Trizol萃取DNA，進(jìn)行全基因組PCR芯片檢測(cè)。通過分析基因芯片，獲得BMSCs在成骨誘導(dǎo)條件下向成骨細(xì)胞分化的過程中Wnt信號(hào)通路調(diào)控基因的變化情況，找出成骨調(diào)控的關(guān)鍵基因。結(jié)果顯示:Wnt信號(hào)通路在調(diào)控BMSCs成骨分化的過程起著重要的作用，但是它并非是單獨(dú)作用的，還有MAPK信號(hào)通路、TGF-β(BMP)信號(hào)通路也參與其中，Wnt信號(hào)通路的兩條支路也互相關(guān)聯(lián)。通過基因芯片分析，我們發(fā)現(xiàn)LRP5在BMS

4、Cs向成骨分化的過程中上調(diào)倍數(shù)為11.15倍;Wnt5b的下調(diào)倍數(shù)為19.34倍，β-catenin的上調(diào)倍數(shù)沒有顯著性差異，但是β-catenin是Wnt信號(hào)通路在胞內(nèi)和胞核之間聯(lián)通的重要因子，也是Wnt信號(hào)通路和其他信號(hào)通路關(guān)聯(lián)的連接點(diǎn)，因此我們選擇了LRP5、Wnt5b、β-catenin作為目的基因進(jìn)行后續(xù)的研究。
　　第二部分：純鈦表面經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制研究。構(gòu)建了含目的基因LRP5的四條

5、慢病毒載體(2723、2724、2725、2726)，設(shè)立陰性對(duì)照組（NC對(duì)照組）和空白對(duì)照組BLANK。通過RT-PCR和WB篩選出有效的基因片段(2725、2726)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。LV3-LRP5(干擾型LRP5慢病毒)侵染BMSCs后，檢測(cè)BMSCs向成骨分化過程中LRP5、β-catenin、BMP2基因、蛋白表達(dá)量的改變，同時(shí)通過ALP、OC和茜素紅染色等成骨指標(biāo)檢測(cè)來驗(yàn)證LV3-LRP5侵染BMSCs后對(duì)其成骨分化能力的改變

6、。根據(jù)每組的差別，我們選擇了侵染72h作為最佳侵染時(shí)間。LV3-LPR5侵染BMSCs后可以檢測(cè)到LRP5、β-catenin、BMP2基因表達(dá)量和蛋白表達(dá)量顯著性下降，同時(shí)測(cè)得7天、14天ALP、OC表達(dá)量的顯著性下降，說明作為膜上受體的LRP5在Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的傳導(dǎo)中起著重要的作用，它通過降低胞內(nèi)β-catenin的集聚，阻斷Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的傳導(dǎo)，阻斷了BMSCs向成骨分化的過程。同時(shí)也說明這個(gè)調(diào)控過程有TGF-β信號(hào)通路的

7、參與。構(gòu)建了含目的基因β-catenin的四條慢病毒載體(3081、3082、3083、3084)，設(shè)立NC對(duì)照組和空白對(duì)照組BLANK。通過RT-PCR和WB篩選出有效的基因片段(3083)。LV3-β-catenin慢病毒侵染BMSCs后，檢測(cè)BMSCs向成骨分化過程中的β-catenin、LRP5、BMP2基因、蛋白表達(dá)量的改變，同時(shí)通過ALP、OC和茜素紅染色等成骨指標(biāo)檢測(cè)來驗(yàn)證LV3-β-catenin侵染BMSCs后對(duì)其成骨

8、分化能力的改變。根據(jù)每組的差別，我們選擇了侵染72h作為最佳侵染時(shí)間。LV3-β-catenin侵染BMSCs后可以檢測(cè)到β-catenin、LRP5、BMP2基因表達(dá)量和蛋白表達(dá)量的顯著性下降，同時(shí)測(cè)得7天、14天ALP、OC表達(dá)量的下降，說明β-catenin被干擾后阻斷了BMSCs向成骨分化的過程，這個(gè)調(diào)控過程有BMP信號(hào)通路的參與。
　　第三部分：純鈦表面非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路對(duì)BMSCs向成骨分化的調(diào)控機(jī)制研究；構(gòu)建了含

9、目的基因Wnt5b的四條慢病毒干擾載體(484、918、975、1579)和過表達(dá)慢病毒載體(v5053)，設(shè)立NC對(duì)照組和空白對(duì)照組BLANK。通過RT-PCR和WB篩選出有效的基因片段(1579，v5053)。LV3-Wnt5b和LV5-Wnt5b（過表達(dá)型慢病毒）分別侵染BMSCs后，檢測(cè)BMSCs向成骨分化過程中Wnt5b、LRP5、BMP2、β-catenin基因、蛋白表達(dá)量的改變，同時(shí)通過ALP、OC和茜素紅染色等成骨指標(biāo)檢

10、測(cè)來驗(yàn)證BMSCs向成骨分化的能力。選擇侵染72h作為最佳侵染時(shí)間。當(dāng)BMSCs有效轉(zhuǎn)染LV3-Wnt5b后，Wnt5b被干擾，從RT-PCR結(jié)果和WB結(jié)果來看，Wnt5b、LRP5、BMP2、β-catenin的表達(dá)量均下調(diào)，結(jié)合ALP、OC、茜素紅的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)BMSCs成骨分化的進(jìn)程被阻斷;當(dāng)BMSCs轉(zhuǎn)染LV5-Wnt5b，即Wnt5b過表達(dá)，可發(fā)現(xiàn)Wnt5b、LRP5、BMP2、β-catenin的表達(dá)量均上調(diào)，進(jìn)一步通過ALP

11、、OC、茜素紅的結(jié)果驗(yàn)證了LV5-Wnt5b在促進(jìn)BMSCs的成骨分化過程中發(fā)揮作用，可以認(rèn)為Wnt5b參與的Wnt非經(jīng)典信號(hào)通路也參與調(diào)節(jié)BMSCs向成骨分化的過程，它和Wnt經(jīng)典通路共同作用，對(duì)Wnt經(jīng)典通路起一個(gè)正性調(diào)節(jié)的作用。本研究表明：⑴密度梯度離心法和傳代貼壁篩選法結(jié)合提純的BMSCs純度高，可以滿足做為體外成骨細(xì)胞誘導(dǎo)模型的實(shí)驗(yàn)要求。⑵純鈦表面上Wnt經(jīng)典信號(hào)通路對(duì)BMSCs成骨分化具有促進(jìn)作用。⑶LRP5的干擾，阻斷了W