雌激素促進(jìn)BMSCs成骨分化過程中細(xì)胞骨架變化及PI3K-Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用研究.pdf

1、正畸牙齒移動(dòng)是一個(gè)骨改建的過程，因而骨的生長與代謝直接或間接地影響正畸治療效果。雌激素作為調(diào)控骨改建的重要條件之一，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，保護(hù)細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡的作用。研究表明，一定濃度的雌激素可以使體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力增強(qiáng)。
　　在細(xì)胞水平上，骨組織對(duì)雌激素刺激的反應(yīng)涉及復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，其中細(xì)胞骨架扮演著重要角色。它主要參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分裂分化、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸以及跨膜信息傳遞等。PI3K/Akt途徑通過改變下

2、游分子的磷酸化狀態(tài)直接調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、生長及凋亡等功能。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中，雌激素能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為探討雌激素促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程與細(xì)胞骨架和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)性，本研究采用熒光染色觀察BMSCs細(xì)胞骨架變化并用原子力顯微鏡觀察BMSCs活細(xì)胞細(xì)胞骨架的變化；通過實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot免疫印跡分析方法，觀察了Akt、pAkt在雌激素促BMSC

3、s成骨分化過程中的表達(dá)及變化，同時(shí)分析PI3K抑制劑對(duì)Akt、pAkt的影響及機(jī)制。旨在進(jìn)一步闡明雌激素促進(jìn)BMSCs成骨分化的作用機(jī)制，充實(shí)雌激素調(diào)節(jié)骨代謝的作用機(jī)理。
　　研究內(nèi)容分為三個(gè)部分：
　　實(shí)驗(yàn)一、大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　目的：分離、純化培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。方法：1.運(yùn)用全骨髓貼壁法和密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，用BMSCs專用培養(yǎng)

4、基接種培養(yǎng)，通過MTT法分析生長曲線，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原，利用BMSCs成骨成脂向誘導(dǎo)分化等方法鑒定細(xì)胞。結(jié)果：MTT測(cè)試發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長曲線呈典型的“S”型，符合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生長特征；細(xì)胞表面抗原檢測(cè)顯示所培養(yǎng)的BMSCs為：CD29和CD44陽性，CD11b和CD45為陰性；經(jīng)成骨、成脂向分化誘導(dǎo)，獲得了茜素紅染色陽性的類成骨細(xì)胞和油紅O染色陽性的類脂肪細(xì)胞。
　　結(jié)論：所采用的細(xì)胞分離培養(yǎng)方法簡便可行，所

5、獲得的細(xì)胞其表型特征與文獻(xiàn)報(bào)道一致，并具有多向分化潛能，確定為BMSCs。
　　實(shí)驗(yàn)二、雌激素促進(jìn)BMSCs成骨分化過程早期細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的變化
　　目的：研究17β-雌二醇對(duì)體外培養(yǎng)大鼠BMSCs細(xì)胞形態(tài)的影響，以及這種影響與成骨分化的關(guān)系。方法：以實(shí)驗(yàn)一中獲得的大鼠BMSCs為研究對(duì)象，設(shè)立陰性對(duì)照組（只加DMEM培養(yǎng)液）、陽性對(duì)照組（加入DMEM和成骨誘導(dǎo)液）和雌激素處理組（10-6mol/L17β-雌二醇）。分別采用

6、免疫熒光染色法觀察BMSCs細(xì)胞骨架的變化以及用原子力顯微鏡觀察BMSCs活細(xì)胞細(xì)胞表面形態(tài)的變化。結(jié)果：BMSCs經(jīng)10-6mol/L17β-雌二醇處理后，實(shí)驗(yàn)組BMSCs細(xì)胞骨架清晰，F(xiàn)-actin熒光顯著增強(qiáng)，高于陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。經(jīng)定量分析，計(jì)算細(xì)胞骨架灰度值，也證實(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞骨架熒光強(qiáng)度高于兩個(gè)對(duì)照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。原子力顯微鏡觀察BMSCs活細(xì)胞，2小時(shí)后陰性對(duì)照組細(xì)胞出現(xiàn)收縮，細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)的應(yīng)力纖

7、維不清晰；陽性對(duì)照組細(xì)胞骨架逐漸增粗；雌激素處理組細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)應(yīng)力纖維變得粗大。結(jié)論：17β-雌二醇影響B(tài)MSCs內(nèi)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞骨架熒光強(qiáng)度，使細(xì)胞骨架應(yīng)力纖維增粗，從而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)三、PI3K/Akt信號(hào)通路在雌激素促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用研究
　　目的：本實(shí)驗(yàn)旨在研究PI3K/Akt信號(hào)通路是否參與介導(dǎo)了雌激素促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化的過程。方法：1、RT-PCR檢測(cè)各組在不同處理時(shí)

8、間下Akt、I型膠原、Runx2、OPN的表達(dá)。2、RT-PCR檢測(cè)各組在不同雌激素處理濃度下Akt、I型膠原、Runx2的表達(dá)。3、Western-blot檢測(cè)各組Akt和pAkt蛋白的表達(dá)。結(jié)果：1、雌激素可促進(jìn)AktmRNA的表達(dá)，且與I型膠原出現(xiàn)的時(shí)間一致，都在成骨分化早期出現(xiàn)。2、不同濃度雌激素促進(jìn)AktmRNA上調(diào)的影響有差異，10-8mol/L17β-雌二醇處理組Akt基因表達(dá)量高于其他組。且PI3K抑制劑能顯著抑制Akt